Введение

По данным ВОЗ, чрезмерное потребление алкоголя служит третьей причиной глобального бремени болезней и относится к ведущим факторам уменьшения продолжительности жизни и повышения смертности населения. Неблагоприятные медицинские и социальные последствия злоупотребления алкоголем определяют актуальность поиска новых средств и методов эффективной профилактики и лечения алкоголизма.

В соответствии с теорией побудительной сенсибилизации [1], аддиктивные состояния возникают вследствие вызываемой психоактивными веществами (ПАВ) гиперчувствительности в мезокортикальных системах головного мозга. При многократном действии этанола наблюдается развитие поведенческой психомоторной сенсибилизации, которая играет важную роль в формировании алкогольной зависимости [2]. Повышенная чувствительность некоторых линий мышей к развитию этанол-индуцированной сенсибилизации сравнивается с аналогичным наблюдением в популяциях людей с высоким риском развития алкогольной зависимости [3]. Несмотря на то, что физиологические механизмы развития двигательной сенсибилизации остаются до конца неясными, предполагается, что она связана с определёнными нейропластическими изменениями, обусловленными многократным действием алкоголя.

Психомоторная активация отражает включение стимулирующих систем мозга, в том числе дофаминергической системы, и может быть использована как подтверждение гиперчувствительности соответствующих мотивационных цепей, которые и выполняют основную роль в формировании аддиктивного влечения к ПАВ. У мышей этанол в низких и умеренных дозах вызывает стимуляцию двигательной активности, что, по мнению ряда авторов, имитирует алкоголь-индуцированную эйфорию у людей [4, 5].

В комплексной медикаментозной терапии алкоголизма важное место занимают анксиолитики бензодиазепинового ряда, временно купирующие проявления психопатологической симптоматики, возникающей на фоне абстинентного синдрома. Однако значительным ограничением их использования в фармакотерапии алкогольных расстройств является их способность потенцировать эффекты этанола. С другой стороны, ранее установлено, что оригинальный отечественный препарат афобазол, эффективный при лечении тревожных расстройств [6], в диапазоне анксиолитических доз 1,0–5,0 мг/кг при однократном введении не влияет на продолжительность алкогольного наркоза и не влияет на миорелаксацию, индуцированную этанолом [7].

В данной работе изучено действие афобазола при однократном введении на вызванную этанолом гиперлокомоторную реакцию и проявление поведенческой сенсибилизации.

Материалы и методы

Эксперименты выполнены на инбредных мышах-самцах линии DBA/2 (n = 158, масса тела 18-22 г) и беспородных белых крысах-самцах (n = 44, масса 200-250 г) (ФГБНУ «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства», филиал «Столбовая»). Мышей содержали по 10-12 особей в клетке (370 х 200 х 150 мм) в стандартных условиях вивария ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» при регулируемом световом режиме 12 ч/12 ч (свет/темнота) и постоянной температуре (21-23 °С) со свободным доступом к воде и брикетированному корму в течение 10 суток до начала тестирования. Организация и проведение работ осуществлялись в соответствии с приказом Минздрава России №199 от 01 апреля 2016 года «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики». Животные содержались в соответствии с СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 29 августа 2014 г. №51. Проведение экспериментов одобрено Комиссией по биомедицинской этике ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова».

Афобазол (субстанция, синтезированная в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова) в дозах 1,0 и 10,0 мг/кг, налоксон гидрохлорид (Sigma Aldrich) в дозе 1,0 мг/кг и этанол, 20 % р-р (ООО «Главспирт»)   в дозе 2,0 г/кг для мышей и в дозах 0,5; 0,75; 1,5 г/кг для крыс растворяли в воде для инъекций. Все вещества вводили внутрибрюшинно (в/б) из расчёта: мышам – 0,1 мл/10 г; крысам объём 20 % раствора этанола вводили соответственно дозе и весу животного. Животным из контрольных групп вводили воду для инъекций в эквивалентных объёмах. Выбор доз афобазола для исследования основан на ранее полученных данных о способности афобазола ослаблять эффекты морфина в опытах in vivo [8].

Тест «Стимуляция двигательной активности этанолом»

Двигательную активность мышей и крыс регистрировали в актометре OPTO-VARIMEX 4 (Columbus Instruments, USA), оснащённом 8 парами ИК-датчиков на высоте 1,27 см от пола, расположенных по периметру 40х40 см экспериментальной установки, при естественном освещении в течение 10 минут. Сразу после введения этанола (крысам – в дозах 0,5; 0,75; 1,5 г/кг и мышам – в дозе 2,0 г/кг в виде 20 % раствора, в/б) животных помещали в OPTO-VARIMEX 4 и автоматически фиксировали общее расстояние (в см), пройдённое животными. Исследуемые препараты вводили за 30 мин до инъекции этанола. Для оценки влияния афобазола на формирование и проявление двигательной сенсибилизации, индуцированной этанолом, использовали описанные ранее схемы эксперимента [7, 9].

Тест «Двигательная сенсибилизация, индуцированная этанолом»

Для оценки влияния афобазола на проявление двигательной сенсибилизации, индуцированной этанолом, использовали описанную ранее 15-дневную схему эксперимента [9]: 0-й день – определение базового уровня двигательной активности мышей; с 1-го по 9-й день – формирование поведенческой сенсибилизации (этанол в дозе 2,0 г/кг/день, в/б); с 10-го по 14-й день – отмена этанола; 15-й день – проявление сенсибилизации (регистрация двигательной активности после предъявления этанола в тест-дозе 2,0 г/кг, в/б). Регистрировали двигательную активность у животных на 0 (фон), 1, 9, 14 и 15-й дни в течение 10 мин. Афобазол в дозе 10,0 мг/кг вводили однократно на 15-й день эксперимента за 30 мин до тест-дозы этанола. Способность фармакологических агентов ослаблять проявление поведенческой сенсибилизации, вызываемой этанолом, может указывать на влияние изучаемых веществ на подкрепляющие свойства этанола.

Полученные данные обрабатывали статистически с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим применением критерия Дункана, а также t-критерия Стьюдента, критерия Манна-Уитни. Данные графиков представлены в виде средних значений и стандартной ошибки среднего.

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследования было необходимо выбрать адекватную биологическую модель для оценки острых эффектов этанола на двигательную активность животных. Большинство исследований по изучению активности афобазола в отношении алкогольного поведения ранее проведены на беспородных и инбредных крысах [7], поэтому сначала для эксперимента были выбраны беспородные крысы. Животных после введения 20 % раствора этанола в дозах 0,5; 0,75 и 1,5 г/кг, в/б, сразу помещали в актометр на 10 мин для регистрации спонтанной двигательной активности. Показано, что в диапазоне низких (анксиолитических) доз этанол вызывал дозозависимое снижение двигательной активности у крыс (рис. 1). Статистически значимое уменьшение пройдённого расстояния отмечалось начиная с дозы 0,75 г/кг, а максимальное угнетение локомоторной реакции наблюдалось под действием этанола в дозе 1,5 г/кг (p < 0,001). Подобное седативное действие, а также выраженная атаксия и нарушение координации движений, возникающие под действием низких доз этанола у беспородных взрослых крыс, описаны в работе Chuck TC, et al. (2006). Авторы отмечают значительное угнетение локомоторной реакции при действии этанола уже начиная с дозы 0,25 г/ кг [10]. С другой стороны, имеются единичные доказательства стимулирующих свойств этанола в дозе 2,0 г/ кг, полученные на беспородных крысах в подростковом возрасте (постнатальный период 32 дня) [11]. Таким образом, полученные результаты указывают на неадекватность данной биологической модели поставленным целям исследования, поскольку использование крыс (постнатальный период 65-70 дней) из беспородной популяции не позволяет выявить фармакологический эффект этанола – стимуляцию двигательной активности.

На втором этапе исследований, опираясь на данные литературы, в эксперимент были включены инбредные мыши-самцы линии DBA/2, отличающиеся повышенной чувствительностью к формированию поведенческой сенсибилизации при повторном действии этанола [9, 12]. При предварительном (фоновом) тестировании мышей линии DBA/2 в актометре показано, что базовый уровень двигательной активности животных из контрольных и опытных групп не отличается. Этанол при однократном введении в дозе 2,0 г/кг, в/б, вызывал у мышей DBA/2 статистически значимое увеличение двигательной активности в течение 10 минут наблюдения по сравнению с контрольной группой, получавшей воду для инъекций (рис. 2). Эти данные соответствует ранее опубликованным результатам, свидетельствующим о роли генотипа в формировании локомоторной сенсибилизации к этанолу и подчеркивающим феноменологическую особенность именно мышей линии DBA/2, которые, в отличие от мышей линии C57Bl/6, как в подростковом, так и во взрослом состоянии демонстрируют наиболее выраженную реакцию на стимулирующее действие этанола [12].

Оценка влияния афобазола на индуцированную этанолом двигательную активность

Опыты выполнены на интактных мышах-самцах линии DBA/2 (n = 134). Этанол в дозе 2,0 г/кг вызывал статистически значимое увеличение двигательной активности у мышей DBA/2 (p < 0,05) по сравнению с контрольной группой (рис. 2). Афобазол в анксиолитической дозе 1,0 мг/кг, в/б, при отсутствии влияния на спонтанную двигательную активность животных perse, не изменял этанол-индуцированную гиперлокомоторную реакцию при предварительном введении. При увеличении дозы препарата до 10,0 мг/кг, в/б, афобазол perse вызывал активацию поведения мышей DBA/2 (p < 0,05), однако при предварительном введении препятствовал формированию этанол-индуцированной гиперлокомоторной реакции (p < 0,05) (см. рис. 2), что указывает на возможное взаимодействие афобазола в большой дозе с этанолом. Выбранный в качестве препарата сравнения налоксон в дозе 1,0 мг/кг, в/б, не обладая собственной психостимулирующей активностью, препятствовал формированию этанол-индуцированной гиперлокомоторной реакции (p < 0,05), как и афобазол (рис. 2).

Оценка влияния афобазола на проявление поведенческой сенсибилизации, вызываемой этанолом

Опыты выполнены на мышах-самцах линии DBA/2 (n = 24) со сформированной двигательной сенсибилизацией. У мышей, получавших этанол с 1-го по 9-й дни, на 9-й день эксперимента при предъявлении тест-дозы этанола 2,0 г/кг, в/б, наблюдалась выраженная гиперлокомоторная реакция в обеих группах, которая превосходила двигательную активность в 1-й день эксперимента (p < 0,01). На 15-й день эксперимента после 5-дневного перерыва при предъявлении тест-дозы этанола 2,0 г/кг, в/б, в группе «контроль» также наблюдалась выраженная гиперлокомоторная реакция (p < 0,001), что доказывает развитие гиперчувствительности к этанолу. Афобазол в эффективной дозе 10,0 мг/кг, в/б, препятствующей формированию этанол-индуцированной гиперлокомоторной реакции, при однократном введении статистически значимо (p < 0,05) блокировал проявление двигательной сенсибилизации, вызываемой этанолом на 15-й день (рис. 3).

Ранее нами была показана способность неселективного антагониста опиоидных рецепторов налоксона в дозе 1,0 мг/кг, в/б, блокировать индуцированную этанолом гиперлокомоторную реакцию у мышей DBA/2 [9], что согласуется с полученными в настоящей работе данными.

Афобазол, одной из рецепторных мишеней которого являются σ1-рецепторы [13–15], в анксиолитической дозе не оказывал влияния на этанол-индуцированную гиперлокомоторную реакцию у мышей DBA/2, подобно другим агонистам σ1-рецепторов [16]. При увеличении дозы афобазола в 10 раз наблюдалось статистически значимое ослабление вызванной этанолом стимуляции двигательной активности мышей DBA/2, что может быть обусловлено вовлечением иных механизмов действия афобазола, в частности МТ1 и МТ3 рецепторов [14].

В настоящем исследовании впервые установлена способность афобазола купировать проявление (экспрессию) сформированной поведенческой сенсибилизации к этанолу. Информации о роли σ1-рецепторов в развитии этанол-индуцированной поведенческой сенсибилизации (ЭИПС) нет, однако известно, что вызываемое при повторных введениях кокаина прогрессивное увеличение экспрессии гена σ1-рецепторов, совпадающее с устойчивым увеличением двигательной активности у мышей, наблюдается в отделах мозга, ответственных за формирование аддиктивных состояний. Кроме того, блокада σ1-рецепторов приводит к ослаблению описанных выше молекулярных адаптаций и кокаин-индуцированной поведенческой сенсибилизации [17], поэтому гипотеза о возможности афобазола купировать ЭИПС за счёт взаимодействия с σ1-рецепторами представляется маловероятной.

Имеются объективные доказательства того, что мелатонин модифицирует физиологический и поведенческий ответ на действие психостимуляторов, при этом установлена роль МТ1 и МТ2-рецепторов мелатонина в формировании метамфетамин-индуцированной поведенческой сенсибилизации. Показано, что даже после однократного введения метамфетамина через 8 дней при предъявлении тест-дозы метамфетамина наблюдалось статистически значимое увеличение двигательной активности у мышей с высокой экспрессией мелатонина C3H/HeN и низкой экспрессией мелатонина C57BL/6, но не у мышей-нокаутов по МТ1-рецептору [18], что позволяет рассматривать МТ1-рецепторы как новую перспективную мишень для фармакологической коррекции состояний лекарственной зависимости.

С другой стороны, на мышах-нокаутах установлена роль α1-субъединицы ГАМКА-рецептора в стимуляции поведения при остром введении этанола [19], а в ряде публикаций двигательная сенсибилизация в ответ на многократные введения этанола у мышей DBA/2 ассоциируется с изменениями экспрессии генов субъединиц ГАМКА-рецептора и чувствительности к ГАМК-ергическим препаратам [20]. Учитывая модулирующее действие афобазола на ГАМК-ергическую систему [21], нельзя исключить, что его ослабление проявления поведенческой сенсибилизации, вызываемой этанолом, в определённой степени связаны с регуляторным влиянием на ГАМК-систему.

Учитывая полученные результаты о взаимодействии афобазола с этанолом на модели поведенческой сенсибилизации, представляется целесообразным продолжить исследования афобазола на других моделях лекарственной зависимости. Таким образом, в ходе выполненных исследований была установлена способность афобазола в дозе 10,0 мг/кг при однократном системном введении предупреждать этанол-индуцированную стимулирующую реакцию и препятствовать проявлению вызываемой этанолом поведенческой сенсибилизации.