Введение

Исследования острой токсичности химических соединений имеют давнюю, более чем вековую историю и не утратили своего значения [1]. С точки зрения получения фундаментальных знаний важность этих исследований определяется получением новых сведений о токсичности тех или иных веществ, что определяет направления новых химических синтезов, пополняет соответствующие библиотеки подходов insilico, расширяет представления о видовой зависимости летальных эффектов и раскрывает множество других принципиально важных параметров, характеризующих взаимодействие в системе вещество – живой организм.

С практической точки зрения оценка острой токсичности – необходимый этап доклинических исследований, определяющий принципиальную возможность превращения фармакологического вещества в лекарство, а также предоставляющий базовые данные, позволяющие судить о начальной (стартовой) дозе для клинических исследований; диапазоне условно безопасных доз, фокусах клинического мониторинга потенциальных нежелательных явлений.

В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» разработано новое оригинальное лекарственное средство ГМЛ-1 – быстродействующий анксиолитик на основе производного пирроло [1, 2-а] пиразина, лиганда 18 кДа транслокаторного белка (TSPO). Оценка острой токсичности является необходимым этапом доклинического исследования безопасности ГМЛ-1.

Целью настоящей работы явилось изучение острой токсичности ГМЛ-1.

Задачи исследования – установить среднелетальные дозы ГМЛ-1, оценить выраженность его токсического действия и переносимость при однократном пероральном и внутрибрюшинном введении, зарегистрировать сроки развития интоксикации и гибели животных с подробным описанием наблюдаемой клинической картины, а также определить класс токсичности ГМЛ-1.

Материалы и методы

В эксперименте использовали таблеточную массу ГМЛ-1, предназначенную для формирования таблеток ГМЛ-1 г/х пролонгированного. Каждые 100 г массы содержали ГМЛ-1 – 1 г; МСС-101 – 88 г; Kollidon – 6 г, PolyplasdonXL – 4 г; магния стеарат – 1 г. ГМЛ-1 был произведён в опытно-технологическом отделе ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» (серия 220916).

Из таблеточной массы готовили суспензию extempore дисперсионным методом на 1 % растворе крахмала. Исследование проводили на белых беспородных мышах (n = 48, масса 18–20 г) и белых беспородных крысах (n = 48, масса 180–220 г), обоего пола в соотношении 1:1. Животные содержались в виварии в соответствии с ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики». Животные были акклиматизированы в помещении вивария в течение 5 дней до начала проведения испытаний. Во время данного периода ежедневно проводили осмотр внешнего состояния животных, патологических отклонений у крыс и мышей не было обнаружено [2–4]. Группы животных формировали методом случайного отбора с использованием массы тела в качестве ведущего признака (разброс по исходной массе между и внутри групп в пределах одного пола не превышал ±10 %).

ГМЛ-1 вводили однократно в дозах: 4 г/кг (таблеточная масса) или 40 мг/кг (активное вещество) перорально самкам и самцам мышей и крыс; 1 г/кг (таблеточная масса) или 10 мг/кг (активное вещество) внутрибрюшинно самкам и самцам мышей и крыс. ГМЛ-1 вводили в максимально возможных объёмах для каждого из способов введения и для каждого из видов животных (мыши – 0,5 мл перорально и 1 мл внутрибрюшинно; крысы – 5 мл перорально и 5 мл внутрибрюшинно), в максимально возможных для введения концентрациях (16 % – при пероральном введении мышам и крысам, 2 % – при внутрибрюшинном введении мышам, 4 % – при внутрибрюшинном введении крысам). Животные контрольных групп получили эквивалентный объём 1 % раствора крахмала однократно. Препараты вводили перорально с помощью металлического атравматического зонда и внутрибрюшинно с помощью одноразовых шприцов [5].

Далее наблюдали за опытными и контрольными группами в течение 14 сут. Первые 8 ч после введения препарата каждая особь находилась в индивидуальной, прозрачной, пластиковой камере для непрерывного визуального наблюдения. Затем животных помещали в клетки группового содержания и осматривали ежедневно утром и вечером с целью выявления их возможной гибели, а также описания их общего состояния и особенностей поведения [6, 7]. Массу тела животных определяли перед введением ГМЛ-1 или 1 % раствора крахмала. В первую неделю наблюдения мышей и крыс взвешивали ежедневно, со второй недели наблюдения и до окончания эксперимента – еженедельно. Суточное потребление корма и воды фиксировали до введения ГМЛ-1 или 1 % раствора крахмала, а также в первые, седьмые и четырнадцатые сутки эксперимента. Животных, павших в ходе исследования, вскрывали. Эвтаназию и патологоанатомическое вскрытие всех животных проводили через 14 суток после введения препаратов [2].

Статистическую обработку полученных данных по динамике массы тела и её прироста проводили следующим образом. Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро–Уилка, гомогенность дисперсий проверяли с помощью критерия Левена для множественных сравнений. Так как распределение изучаемых данных значимо не отличалось от нормального, а дисперсии были гомогенны, то для определения статистической значимости изменений использовали параметрические методы. Для сравнения нескольких выборок применяли однофакторный дисперсионный анализ или дисперсионный анализ для повторных измерений с дальнейшей обработкой методом множественных сравнений по Даннету. В случае сравнения двух выборок использовали t-критерий Стьюдента. Полученные результаты описывали с помощью средних арифметических и их стандартных ошибок. Различия считали статистически значимыми при p< 0,05.

Результаты и обсуждение

При изучении острой токсичности препарата ГМЛ-1 на беспородных белых мышах и крысах обоего пола при пероральном или внутрибрюшинном введении определение средней смертельной дозы не представлялось возможным из-за отсутствия гибели животных в условиях достижения максимально возможных концентраций и максимально допустимых объёмов введения.

В ходе эксперимента у мышей и крыс, получивших ГМЛ-1 перорально или внутрибрюшинно, отмечалось постепенное угнетение двигательной активности, нарушение ритма дыхания, которое было учащённым и поверхностным или, наоборот редким. Не было отмечено нарушений ушного и корнеального рефлексов. Когда через 8 ч животных помещали в клетки группового содержания, двигательная активность восстановилась, отдельные особи (мыши) были гиперактивны, выпрыгивали из рук, вокализировали. При этом мыши и крысы были сгорбленными, с взъерошенной шерстью, бока у некоторых были втянуты. Следует подчеркнуть, что уже к началу вторых суток после введения ГМЛ-1 большинство мышей и крыс были активны и любопытны. При этом многие опытные животные оставались сгорбленными, шерсть была взъерошена. В дальнейшем внешний вид и состояние опытных мышей и крыс постепенно нормализовались, к концу первой недели и до окончания эксперимента животные были активны, охотно потребляли корм, пили воду. Поведение экспериментальных мышей и крыс в этот период наблюдения не отличалось от поведения животных контрольной группы.

В первые двое суток после введения препарата отмечалось резкое уменьшение потребления корма и воды (табл. 1, 2), а также резкое снижение массы тела и её прироста у всех опытных животных. Масса тела и её прирост у мышей и крыс, получивших ГМЛ-1 перорально или внутрибрюшинно, начинали возрастать со 2–3 дня.

В группе мышей, получивших ГМЛ-1 перорально, исходные значения массы у самок были достигнуты лишь на второй неделе, у самцов на 3-й день. К окончанию эксперимента у самцов не отмечено значимых различий в приросте массы тела между опытными и контрольными животными. У самок в течение всего эксперимента показатели прироста были значимо ниже контрольных данных (рис. 1 а, б).

В группе мышей, получивших ГМЛ-1 внутрибрюшинно, первые семь дней показатели прироста массы тела имели отрицательное значение. К окончанию эксперимента показатели прироста массы опытных животных не имели статистических различий с показателями контрольной группы (рис. 1 в, г).

В группе крыс, получивших ГМЛ-1 перорально, у самок с пятых суток и до окончания эксперимента показатели прироста массы тела были в 2 раза ниже контрольных значений. У самцов в течение всего периода наблюдения не отмечено значимых различий в показателях с контрольной группой животных (рис. 1 д, е). В группе крыс, получивших ГМЛ-1 внутрибрюшинно, показатели прироста массы тела у самок достигли положительных результатов на 7-й день, а у самцов на 4-й день. Показатели прироста массы опытных самок в течение всего эксперимента были значительно ниже контрольных данных (рис. 1 ж, з).

Важно, что к окончанию эксперимента не было выявлено закономерных различий в показателях прироста массы тела у опытных животных по сравнению с контрольными значениями. В показателях потребления корма и воды в данных группах к окончанию эксперимента также не было выявлено закономерных различий с контрольными группами (см. табл. 1, 2).

Морфологическая картина внутренних органов, обнаруженная при патологоанатомическом вскрытии всех экспериментальных животных, не отличалась от таковой, наблюдаемой у контрольных животных.

В результате исследования установлено, что ГМЛ-1 при пероральном и внутрибрюшинном введении является малотоксичным и, по классификации Сидорова К.К. (1973 г.), может быть отнесён к 4-у классу токсичности. В соответствии с ГОСТ 12.1.007-76 препарат ГМЛ-1 относится к 3-у классу опасности для перорального способа введения.