Введение

Фактор роста нервов (nerve growth factor – NGF) относится к семейству регуляторных белков – нейротрофинов, принимающих участие в регуляции процессов пролиферации, дифференциации и миелинизации, а также поддержании функциональной активности центральных и периферических нейронов. Помимо этого, нейротрофины и, в частности NGF, играют важную роль в образовании синапсов и регуляции синаптической пластичности [1, 2]. Исторически NGF и его предшественник proNGF рассматривались как одни из основных регуляторов нейрональной функции. Однако в настоящее время накоплен большой литературный материал, свидетельствующий о том, что биологическая роль NGF существенно шире и обусловлена его способностью регулировать процессы выживания клетки, апоптоза, клеточной пролиферации, воспаления, ангиогенеза и ремоделирования тканей [3]. В частности показано, что NGF является одним из ключевых эндогенных регуляторов ангиогенеза и, помимо ЦНС, синтезируется и экскретируется эндотелиальными и гладкомышечными клетками сосудов, а на их клеточной мембране представлены специфичные для NGFTrkA рецепторы [4, 5], посредством взаимодействия с которыми NGF реализует свои ангиогенные эффекты. NGF-опосредованная активация TrkA рецепторов, расположенных на клеточных мембранах эндотелиальных и гладкомышечных клеток сосудов, влечёт за собой активацию PI3K-Akt, Ras-MAPK и PLC1-IP3 внутриклеточных сигнальных путей, инициирующих неоангиогенез [6–8]. Этот феномен описан как для нормальных, так и патологически изменённых тканей. Цель настоящего исследования – изучение ангиогенной активности NGF на интактной и повреждённой культуре изолированных клеток эндотелия человека HUVEC.

Материалы и методы

Интактные клетки. Оценку ангиогенной активности NGF (BDBioscience) проводили на культуре клеток эндотелия человека (HUVEC). Клетки эндотелия рассаживали в среде ДМЕМ (HyClone), содержащей 20 мМ Hepes (ICN), 2 мМ L-глутамина (ICN), гепарин (5 Ед/мл) (Панфарма), ECGF (200 мкг/мл) (Sigma), 10 % FBS (Invitrogen) с плотностью 4,0 тыс. на лунку в 96-луночные планшеты, покрытые поли-Д-лизином. NGF (10–9 М) вносили через 30 мин после рассеивания клеток на планшеты и затем каждые 48 ч (всего 3 внесения) в течение недели. Через 24 ч после последнего внесения NGF клетки фотографировали с помощью микроскопа NikonEclipseTS100-F (Япония) в фазовом контрасте при увеличении x100. Длину микротрубочек измеряли в 5 полях зрения каждой лунки с использованием программы WCIFImageJ и выражали в микрометрах. Повреждённые клетки. Эксперименты проводили на модели оксидативного стресса [9] в культуре эндотелиальных клеток человека (HUVEC), который вызывали добавлением в культуру клеток перекиси водорода (Н2О2) в конечной концентрации 200 мкМ. Клетки культивировали в той же среде, что и интактные клетки в атмосфере 5 % СО2 при 37 С в течение 24 ч. Далее среду, содержащую Н2О2, заменяли на нормальную и через 24 ч определяли жизнеспособность клеток с помощью МТТ-теста. Светопоглощение измеряли на спектрофотометре «Multiscan» (Thermo) при длине волны 600 нм. Ангиогенную активность NGF оценивали с помощью световой микроскопии при увеличении x200. NGF вносили после отмывки среды с Н2О2 в конечной концентрации 10–9 M и далее каждые 48 ч в течение недели. Через 24 ч после последнего внесения NGF клетки фотографировали с помощью микроскопа NikonEclipseTS100-F (Япония) в фазовом контрасте при увеличении x100. Длину микротрубочек измеряли в 5 полях зрения каждой лунки с использованием программы WCIFImageJ и выражали в микрометрах. В следующей серии экспериментов оценивали антиапоптотическую активность NGF. В качестве маркера апоптоза использовали флюоресцентный краситель Хехст (Hoechst 33258), который позволяет выявить клетки с конденсированным и фрагментированным хроматином, характерным для апоптоза и некроза. Для этой цели клетки фиксировали метанолом. Далее проводили окрашивание клеток ядерным красителем Hoechst 33258 (10 мг/мл) (Serva, FRG) в течение 30 мин при комнатной температуре.

Статистическую обработку результатов проводили следующим образом: Нормальность распределения выборок проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка, гомогеность дисперсий – с помощью критерия Левена. Так как полученные данные были распределены по нормальному закону, а дисперсии выборок были негомогенны, то для определения статистической значимости различий использовали критерий Стьюдента в приближении для выборок с неравными дисперсиями, для учёта множественности сравнений использовали поправку Бонферрони. Результаты выражали в виде средних арифметических и их стандартных ошибок. Различия считали статистически значимыми при р 0,05.

Результаты и обсуждение

На интактной культуре изолированных клеток эндотелия человека (HUVEC) показано, что NGF в концентрации 10–9 M стимулирует начальную стадию ангиогенеза — тубулогенез, о чём свидетельствует статистически значимое (р < 0,001) по сравнению с контролем увеличение средней суммарной длины микротрубочек: контроль — 162 ± 6 мкм; NGF — 330 ± 9 мкм. Таким образом, в этой серии экспериментов нами были подтверждены известные данные литературы о том, что NGF обладает выраженной ангиогенной активностью [7, 10, 11].

В следующей серии экспериментов оценивали ангиопротекторную активность NGF на культуре клеток эндотелия человека (HUVEC), повреждённых перекисью водорода. На первом этапе исследования была отработана модель повреждения клеток сосудистого эндотелия человека высокой концентрацией перекиси водорода. Было показано, что перекись водорода в высокой концентрации (200 мкМ) инициирует повреждение клеток (HUVEC). Так, если длина интактных клеток (контроль) равнялась в среднем 125 ± 24 мкм, то в группе с Н2О2 этот показатель был статистически значимо ниже (р < 0,05), чем в контроле и составлял 87 ± 10 мкм (рис. 1). На следующем этапе изучали ангиопротекторные эффекты NGF, который вносили в лунки после отмывки клеток от Н2О2. Нами показано, что NGF (10–9 M) в условиях оксидативного стресса проявляет значимую (р < 0,05) ангиопротекторную активность: длина клеток в группе NGF практически не отличалась от таковой в интактной группе и составляла соответственно 138 ± 14 мкм и 125 ± 24 мкм (рис. 1).

В последней серии экспериментов изучали антиапоптотические эффекты NGF на культуре (HUVEC), повреждённых перекисью водорода. Результаты экспериментов приведены на рис. 2. Как видно из приведённых данных, добавление в культуру клеток перекиси водорода вызывает повреждение ядер клеток сосудистого эндотелия: в контроле число клеток с конденсированным и фрагментированным хроматином составило 9 ± 2, а после внесения перекиси водорода – 78 ± 9 (р  0,05), что свидетельствует о том, что оксидативный стресс оказывает проапоптотическое действие. NGF (10–9 М) достоверно по сравнению с контролем снижает число повреждённых клеток, соответственно, 44 ± 9 и 78 ± 9 (р  0,05), что позволяет говорить о том, что NGF препятствует развитию морфологических изменений ядерного хроматина, характерных для апоптоза. Известно, что NGF-опосредованная активация TrkA рецепторов, расположенных на клеточных мембранах эндотелиальных клетках сосудов, активирует PI3K-Akt, Ras-MAPK и PLC1-IP3 внутриклеточные сигнальные пути, стимулирующие пролиферацию, миграцию и инвазию эндотелиальных клеток, т. е. инициирует ангиогенез [6–8 и др.]. Помимо этого, NGF может стимулировать ангиогенез посредством активации фактора роста эндотелия сосудов – VEGF-A [11]. Активированный NGF фактор роста эндотелия сосудов (VEGF-A) взаимодействует с FLK-1 рецепторами, в результате чего происходит экспрессия урокиназы и/или её рецепторов [12]. Экспрессия урокиназы является начальным этапом программы, связанной с миграцией клеток, и необходима для перемещения клеток из одного тканевого компартмента в другой [13]. Ключевым моментом процесса клеточной инвазии является взаимодействие урокиназы со специфичным для неё урокиназным рецептором — uPAR. uPAR рецепторы фиксируются к клеточной мембране липидным «якорем» – инозитол-фосфогликаном, — и способны латерально перемещаться в фосфолипидном слое клеточной мембраны и, в случае активации, концентрируются в её определённых участках, в частности в случае миграции клетки на её «лидирующем» полюсе. Такие свойства активированных uPAR рецепторов позволяют осуществлять строго направленную локальную деградацию внеклеточного матрикса, что необходимо для миграции и инвазии клеток [13, 14].

Если ангиогенные эффекты NGF достаточно хорошо известны, то его ангиопротекторное действие практически не изучено. В библиотеке Pub.Med. представлена только одна, опубликованная в 2017 г. статья, свидетельствующая о способности NGF защищать эндотелиальные клетки сосудов от повреждающего действия индометацина [15]. Авторы статьи полагают, что ангиопротекторное действие NGF может быть связано с его способностью препятствовать деполяризации митохондриальной мембраны и/или стимулировать экспрессию IGF-1 (инсулиноподобный фактор роста 1) в эндотелиальных клетках. Близкая ситуация наблюдается в отношении изучения влияния NGF на апоптоз эндотелиальных клеток. В литературе имеются единичные противоречивые сообщения о наличии у NGF или антиапототической [16], или проапототической активности [17].

Заключение

Результаты настоящего исследования подтверждают данные о наличии у NGF ангиогенной активности и свидетельствуют о том, что в условиях повреждения эндотелиальных клеток сосудов оксидативным стрессом он проявляет выраженную ангиопротекторную и антиапоптотическую активность.