По данным всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в период с 2022 по 2045 гг. число диагностированных онкологических заболеваний во всём мире вырастет на 55 % — примерно с 19,9 миллиона случаев рака в 2022 г. до 30,9 миллиона случаев в 2045 г. По мере роста заболеваемости смертность от злокачественных новообразований может возрасти до 16,6 миллиона человек к 2045 г. Очевидно, что важнейшим направлением современной фармакологии является повышение эффективности, снижение токсичности известных препаратов и разработка новых подходов к лечению рецидивирующих онкологических заболеваний за счёт поиска оригинальных соединений с противоопухолевой активностью.

Одной из характеристик механизма действия противоопухолевых средств считается их способность действовать на разные фазы клеточного цикла, основными из которых являются: фаза G1 занимает от 4 до 24 часов (ч), фаза S — фаза синтеза ДНК, которая продолжается 10–20 ч. Фаза G2 считается премитотической, которая длится от 2 до 10 ч, следующей фазой клеточного цикла является митоз (М) — 0,5–1 ч, далее следует стадия покоя (G0). Специфичность повреждения ДНК к фазе клеточного цикла, по-видимому, является предиктором фазы остановки роста в клеточном цикле [1].

Для антрациклинового антибиотика доксорубицина выявлено несколько механизмов цитотоксического действия, основными из которых являются интеркаляция ДНК, ингибирование топоизомеразы II, что приводит к разрыву двухцепочечной ДНК [2, 3], образование свободных радикалов и окислительный стресс, а также повреждение мембран [4]. Существует зависимость цитотоксического действия доксорубицина от концентрации и продолжительности его применения, блокирование клеточного цикла опухолевых клеток достигает максимума в течение S фазы и митоза, при этом ингибирование регистрировали также при переходе G2/M [5, 6].

В ФГБНУ «ФИЦ оригинальных и перспективных биомедицинских и фармацевтических технологий» синтезирован гидрохлорид 2-изобутил-4,6-диметил-5-оксипиримидина (СНК-578) [7]. СНК-578 обладает противоопухолевой, противовоспалительной и антиметастатической активностью на моделях карциномы лёгкого Lewis (LLC) и меланомы В16, наиболее выраженной при совместном введении с доксорубицином [8, 9]. При совместном введении с гемцитабином СНК-578 препятствуют угнетению кроветворения и увеличивают продолжительность жизни у мышей с аденокарциномой Ca755 [10].

Целью настоящей работы является оценка влияния гидрохлорида 2-изобутил-4,6-диметил-5-оксипиримидина (СНК-578) в сравнении с доксорубицином на фазы клеточного цикла клеток Jurkat.

Культивирование клеток

Клетки линии Jurkat (Т-лимфобластная лейкемия человека) из клеточного банка ФГБНУ «НИИ Общей патологии и патофизиологии» размораживали и культивировали с соблюдением условий стерильности в полной питательной среде RPMI-1640 с глутамином («ПанЭко», Россия), 10 % эмбриональной сыворотки телят («Биолот», Россия), подвергнутой инактивации в течение 30 мин при температуре 56 °С, с добавлением 500 мкл раствора гентамицина («ПанЭко», Россия) и аминокислот для среды RPMI-1640 («ПанЭко», Россия) в полуоткрытой системе при температуре 37 °С в атмосфере 5 % СО₂ до получения необходимого количества клеток. Для постановки эксперимента использовали культуры, которые содержали 95 % и более жизнеспособных лимфобластных клеток линии Jurkat. Оценку данного параметра проводили методом микроскопии (микроскоп Nikon Eclipse E200, Япония), используя 0,4 % раствор трипанового синего (Serva, США).

Препараты и соединения

Дизайн исследования

Клетки были разделены на группы: интактная культура клеток и культуры клеток с добавлением исследуемых веществ. Клетки в питательной среде вносили на 12-луночный планшет по 300000 клеток в каждую лунку. Далее в лунки вносили ДОКС в концентрации 10⁻⁵ М в виде раствора в среде или СНК-578 в концентрации 10⁻⁴ М или 10⁻⁵ М в виде раствора в среде и помещали в СО₂-инкубатор на 24 ч и 48 ч. Выбор концентрации ДОКС и СНК-578 основан на данных литературы и ранее проведённых исследованиях [11–13]. Каждая группа дублировалась и эксперимент повторяли дважды. После инкубации клетки дважды отмывали 0,01 М натрий-фосфатным буфером (pH = 7,4) и фиксировали в 70 % охлаждённом этаноле. На следующий день после фиксации клетки центрифугировали 5 минут с ускорением 220 RCF, сливали надосадочную жидкость и вносили по 500 мкл раствора йодистого пропидия с РНКазой А («BioInnIabs», Россия), после чего оставляли в тёмном месте на окрашивание в течение 30 мин. После окрашивания записывали по 25000 событий на пробу на проточном цитометре BD FACSCanto II. Анализ полученных данных проводили с помощью программного обеспечения FlowJo 10.5.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы Statistica 13.5. При расчёте использовалась сумма данных обоих экспериментов: на каждую точку получилось по 8 наблюдений (2 эксперимента и в каждом по 4 наблюдения). Все регистрируемые характеристики представлены в таблицах в виде среднего и стандартного отклонения (Mean±SD). Проверка на нормальность распределения проводилась с применением критерия Шапиро—Уилка. Оценку гомогенности дисперсий проводили по Левену. Значимость влияния факторов при гомогенной дисперсии определялась с помощью дисперсионного анализа ANOVA, с последующей обработкой методом множественных сравнений по Тьюки.

Для исследования действия доксорубицина и СНК-578 на разные фазы клеточного цикла клетки культуры Jurkat были разделены на 4 группы:

По результатам экспериментов установлено, что культивирование клеток культуры Jurkat с доксорубицином и СНК-578 в течение 24 ч (табл. 1) не приводит к изменению клеточного цикла по сравнению с интактным контролем.

Группа, n = 8G1, %S, %G2, %M, %Контроль50,63±6,9833,85±3,3310,51±5,33,42±1,96Доксорубицин 10⁻⁵ М51,50±7,8135,65±7,788,47±0,364,48±0,94СНК-578 — 10⁻⁴ М50,40±7,1635,50±4,699,98±3,943,17±1,79СНК-578 — 10⁻⁵ М50,58±7,2435,18±3,889,91±4,843,02±1,49

При культивировании клеток в течение 48 ч под действием доксорубицина в концентрации 10⁻⁵ М и СНК-578 концентрации 10⁻⁴ М статистически значимо увеличивается доля клеток, находящихся в G1 фазе клеточного цикла, и уменьшается доля клеток, находящихся в S фазе клеточного цикла (табл. 2).

Группа, n = 8G1, %S, %G2, %M, %Контроль53,50±3,2728,33±2,6111,37±3,366,80±5,75Доксорубицин 10⁻⁵ М67,25 ±1,92*ᵃ18,61±1,44*9,71±2,054,43±2,67СНК-578 — 10⁻⁴ М59,85±2,25*20,75±2,05*12,72±4,47,68±5,46СНК-578 — 10⁻⁵ М55,40±3,2426,90±3,3312,26±2,915,44±5,00

Примечания: n — число наблюдений; * — p < 0,05 по критерию Тьюки по сравнению с контролем; ᵃ — p < 0,05 по критерию Тьюки по сравнению с группой СНК 578 10⁻⁴ М.

Острый Т-клеточный лимфобластный лейкоз, относящийся к заболеваниям системы кроветворения, на долю которого приходится примерно 15 % случаев острого лимфобластного лейкоза у детей и 25 % у взрослых, отличается агрессивностью и устойчивостью к химиотерапии [11, 12]. Линия лимфобластоидных клеток человека Jurkat, выделенная из Т-лимфоцитов периферической крови, используется в качестве модельной системы для изучения апоптотической гибели клеток при остром Т-клеточном лейкозе в ответ на противоопухолевую терапию, а также для изучения различной чувствительности к цитостатическому действию [13, 14]. Согласно данным литературы, при обработке доксорубицином в концентрации 10⁻⁵ М клеток Jurkat доля клеток в S фазе клеточного цикла составляла 26±2,9 % [15, 16].

В наших исследованиях блокирование клеточного цикла у доксорубицина достигало максимума через 48 ч инкубации в S фазе, что согласуется с работой Mendivil-Perez M, et al. (2015), в которой доксорубицин вызывал гибель клеток острого лимфобластного лейкоза за счёт апоптоза, индуцированного окислительным стрессом, и путём прямого повреждения ДНК [16]. Однако ингибирующее действие доксорубицина на синтез ДНК было также отмечено и в другие фазы клеточного цикла, но в значительно более низких концентрациях [5].

При культивировании клеток Jurkat в течение 48 ч с СНК-578 только в концентрации 10⁻⁴ М регистрировали увеличение доли клеток, находящихся в G1 фазе клеточного цикла, и сокращение доли клеток, находящихся в S фазе клеточного цикла, что указывает на однонаправленность действия доксорубицина и СНК-578 на синтез ДНК в S фазе клеточного цикла.

При изучении противоопухолевых свойств СНК-578 на модели меланомы В16 в опытах на мышах линии С57BL/6 ранее показано, что СНК-578 при совместном введении с доксорубицином статистически значимо подавляет рост опухоли на 11-, 15- и 21-е сутки её развития, не вызывая значимого уменьшения объёма опухоли при их раздельном введении. При совместном введении СНК-578 (10 мг/кг) и доксорубицин (4 мг/кг) оказывали максимальное антиметастатическое действие, индекс ингибирования метастазирования был равен 98,9 % [8]. Полученные данные на клеточной линии Jurkat подтверждают возможность усиления противоопухолевого действия при совместном применении гидрохлорида 2-изобутил-4,6-диметил-5-оксипиримидина (СНК-578) с доксорубицином.

Таким образом, гидрохлорид 2-изобутил-4,6-диметил-5-оксипиримидина (СНК-578) и доксорубицин при культивировании клеток Jurkat действуют на синтез ДНК в S фазе клеточного цикла. Полученные данные подтверждают возможность усиления противоопухолевого действия при совместном применении СНК-578 и ДОКС, ранее зарегистрированного в модельных опытах in vivo.