Введение 

Нейропептид цикло-L-пролилглицин (L-ЦПГ), синтезированный в ФГБНУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова» [1], был позже обнаружен в мозге крыс [2]. Ноотропный [3], анксиолитический [4], антигипоксический [5] эффекты L-ЦПГ при системном введении были схожи с таковыми при введении пирацетама. Подобно пирацетаму, ЦПГ является положительным модулятором AMPA-рецепторов [6]. Известно, что положительные AMPA-модуляторы обладают нейропротекторным действием на различных моделях in vitro [7]. Исходя из этих данных, можно было предположить наличие нейропротекторного действия и у L-ЦПГ.

Целью работы было выявление нейропротекторного действия L-ЦПГ на различных моделях повреждения in vitro: оксидативного стресса, глутаматной токсичности, клеточной модели болезни Паркинсона, индуцированной нейротоксином 6-гидроксидофамином.

Материалы и методы исследования

L-ЦПГ синтезирован в отделе химии НИИ фармакологии им. В.В. Закусова [8]. Для экспериментов использовались реактивы: глутаминовая кислота (ICN), 6-гидроксидофамин и MTT (Sigma Aldrich), ДМСО (Panreac), среда ДМЕМ (HyClone), фетальная бычья сыворотка FBS (Gibco).

Клетки культивировали в среде ДМЕМ в случае гиппокампальных клеток линии HT-22 с добавлением 5% FBS, в случае клеток нейробластомы человека линии SH-SY5Y — 15% FBS при температуре 37 °С в атмосфере, содержащей 5% CO2.

Глутаматную токсичность моделировали путём внесения в культуральную среду раствора глутаминовой кислоты в конечной концентрации 5 мМ. Через 24 ч среду заменяли на обычную. L-ЦПГ вносили за 24 ч до глутаминовой кислоты или сразу после смены среды. Жизнеспособность клеток измеряли методом MTT-теста через 24 ч [9].

Оксидативный стресс моделировали путём внесения перекиси водорода в конечной концентрации 1,5 мМ. Спустя 30 мин среду заменяли на обычную. Ещё через 4 ч выполняли измерение жизнеспособности клеток методом MTT-теста [10].

Клеточную модель болезни Паркинсона воспроизводили путём внесения раствора 6-гидроксидофа- мина в конечной концентрации 100 мкM. Через 24 ч среду заменяли на обычную. Через 24 ч измеряли жизнеспособность клеток методом MTT-теста [11].

L-ЦПГ вносили за 24 ч до повреждения или сразу после смены среды в концентрациях 10-5 — 10-8М.

Жизнеспособность клеток измеряли с использованием MTT-теста с добавлением 0,5% раствора 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромида (MTT). Для растворения кристаллов формазана использовали ДМСО и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре Multiscan EX при длине волны 600 нм [12].

Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Краскела-Уоллеса с последующим тестом по Данну (ANOVA). Данные представлены в виде m. ± s.d. 

Результаты и их обсуждение

На модели глутаматной токсичности нами показано, что L-ЦПГ в культуре клеток HT-22 в концентрациях 10-5—10-8 моль/л оказывал нейропротекторное действие, но только в схеме внесения за 24 ч до повреждения. При внесении после глутаминовой кислоты нейропротекторное действие выявлено не было (рис. 1).

При моделировании оксидативного стресса путём добавления к культуре клеток HT-22 перекиси водорода L-ЦПГ оказывал защитное действие как при внесении за 24 часа до перекиси в концентрациях от 10-5 моль/л до 10-8 моль/л, так и при внесении после перекиси, но только в концентрации до 10-7 моль/л (рис. 2, 3).

На клеточной модели болезни Паркинсона в культуре клеток SH-SY5Y с использованием 6-ги-дроксидофамина, L-ЦПГ в концентрациях 10-510-8 моль/л, как и в случае глутаматной токсичности, нейропротекторное действие обнаруживалось только при добавлении пептида за 24 часа до токсина в концентрациях 10-5-10-8 моль/л (рис. 4).

Таким образом, нами показано наличие нейропротекторного действия L-ЦПГ на моделях повреждения нейронов in vitro, наблюдавшееся преимущественно при внесении препарата до начала действия повреждающего агента. Эти результаты согласуются с данными литературы о наличии протекторного эффекта у L-ЦПГ на моделях кислородно-глюкозной депривации на первичной культуре гиппокампальных нейронов [13], а также майтотоксин- индуцированного некроза и апоптоза, индуцированного сульфатом железа (II) в зёрнах мозжечка [14]. Защитный эффект L-ЦПГ отсутствовал в схеме внесения после повреждения на модели травматического повреждения кокультуры нейрональных и глиальных клеток, а также апоптоза, индуцированного стауроспорином в культуре зёрен мозжечка [14], и NMDA-экзайтотоксичности на гиппокампальных нейронах [15].

Одним из ключевых звеньев механизма действия L-ЦПГ является его способность к положительной модуляции АМРА-рецепторов [16], что, как известно, приводит к усилению синтеза нейротрофинов, являющихся эндогенными нейропротекторами [7]. Поэтому наличие нейропротекторного эффекта только при внесении за 24 ч можно объяснить, исходя из предположения о том, что L-ЦПГ осуществляет своё защитное действие через положительную модуляцию АМРА-рецепторов и последующий синтез нейротрофинов, на который требуется интервал времени 18-24 ч [17]. Выявленное защитное действие L-ЦПГ в обеих схемах эксперимента на модели оксидативного стресса может быть обусловлено его антиоксидантными свойствами [14] и за счёт возможного влияния на систему антиоксидантной защиты клеток.

Выводы

Цикло-L-пролилглицин оказывает нейропротекторное действие в экспериментах in vitro и это согласуется с литературными данными о его защитном действии в других модельных системах in vitro и in vivo. Полученные результаты согласуются с литературными данными о наличии у положительных модуляторов AMPA-рецепторов нейропротекторных свойств.