Введение 

Разработка препаратов на основе эндогенных соединений — регуляторных пептидов, является одним из направлений в области создания эффективных и безопасных средств для фармакотерапии психоэмоциональных расстройств. Так, синтезированный аналог тафтсина селанк не уступает по выраженности эффекта медазепаму при лечении пациентов с генерализованными тревожными расстройствами [4], однако, особенности гептапептидной структуры не позволяют использовать его для введения внутрь. С другой стороны, для коротких пептидов установлены переносчик-опосредованные транспортные системы, которые определяют их способность к всасыванию в кишечнике, открывая перспективы создания пептидных препаратов для перорального применения [10].

Основываясь на данных о вовлечённости эндогенной холецистокининовой системы в формировании панических состояний и тревожных расстройств, в

ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» сконструирован дипептидный аналог тетрапептида холецистокинина — амид-N-(6-фенилгексаноил) глицил-N-триптофана (соединение ГБ-115), обладающий антагонистической активностью по отношению к центральным холецистокининовым рецепторам [1] и проявляющий в опытах in vivo выраженный анксиолитический эффект [5], не вызывая при этом толерантности и формирования синдрома «отмены» [6]. На этапе доклинического изучения нового анксиолитика пептидной природы изучен с фармакологической/фармакокинетической точки зрения ряд фармацевтических композиций с целью выявления наиболее оптимальной композиции для получения твёрдой лекарственной формы ГБ-115 [2].

Необходимым этапом разработки оригинального лекарственного средства является изучение его экспериментальной фармакокинетики и метаболизма [7]. Выявление общих закономерностей и различий в фармакокинетике фармакологически активных веществ у экспериментальных животных разных видов позволяет наиболее точно экстраполировать значения фармакокинетических параметров на человека. Анализ доклинических исследований очень важен для оценки вероятности развития и характера побочных эффектов, расчёта начальной дозы для изучения свойств препарата у человека, обеспечивает полезной информацией при переносе данных с животных на человека для выбора пути введения, а также для разработки оптимальной лекарственной формы, обеспечивающей фармакологическую активность и биодоступность.

В то же время при разработке нового препарата невозможно обойтись без клинических исследований, поскольку экстраполяция результатов исследований у животных на человека возможна только в общем виде [8].

Цель исследования — клинико-экспериментальное изучение фармакокинетики нового оригинального дипептидного анксиолитика ГБ-115, выявление общих закономерностей и различий в фармакокинетике у экспериментальных животных и человека.

Материалы и методы

В качестве стандартного вещества использовали фармацевтическую субстанцию ГБ-115 (№ серии ЕК-544-В производства ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», дата выпуска 12.01.2015 г., годен до 02.2018 г.) содержание основного вещества в котором было не ниже 98%. Общая характеристика исследуемого вещества приведена в табл. 1.

Синтез осуществлён в опытно-технологическом отделе ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова».

Крысы

Эксперименты выполнены на белых беспородных крысах-самцах (с массой тела 180—220 г), полученных из питомника «Столбовая» (Московская область). Животных содержали по 6 особей в клетке (580x375x200 мм) в стандартных условиях вивария ФБГНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» при естественном освещении, постоянной температуре (21—23 °С) и свободном доступе к брикетированному корму и воде. Все эксперименты были проведены в осенне-зимний период.

До проведения исследования крысы находились в течение 12 ч на водной диете. Субстанцию ГБ-115 вводили в виде водной суспензии с добавлением 1% твина 80 перорально в дозе 100 мг/кг. Животных декапитировали до введения препарата и через 10, 15, 20, 30, 45 и 60 мин после введения суспензии. Плазму крови получали центрифугированием образцов крови животных при 2 500 об/мин в течение 10 мин и 4°С.

Исследование выполнено согласно требованиям «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств» [7].

Кролики

На 6 кроликах-самцах породы шиншилла (питомник «Манихино», Московская область) массой 2,75— 3,10 кг проведено открытое, фармакокинетическое исследование. Животные содержались в стандартных условиях вивария при 12-часовом цикле освещения. За 12 ч до эксперимента животных лишали корма. Кроликам с помощью зонда внутрь вводили субстанцию препарата. Объём суспензии лекарственного средства — 3,0 мл (общая доза ГБ-115 составила 100 мг).

Образцы крови объёмом 1,5 мл отбирали из краевой ушной вены с помощью игл и переносили в конические полиэтиленовые пробирки, предварительно обработанные раствором К2ЭДТА. Взятие образцов крови для последующего определения содержания препарата в плазме крови осуществлялось в дискретные интервалы времени: до введения препарата (0,0) и через 0,25; 0,50; 0,75; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0 и 4,0 ч после введения суспензии. Затем полученные пробы крови центрифугировали в течение 10 мин при 2 500 об/мин и 4 °С. Отбор плазмы крови проводили в стерильные пластиковые криопробирки. Плазма крови хранилась при температуре —50 °С.

Добровольцы 

Клиническое исследование ГБ-115 проведено в соответствии с протоколом № КИ 1-2015 «Открытое клиническое исследование I фазы по изучению фармакокинетики, безопасности и переносимости препарата ГБ-115, таблетки 1 мг у здоровых добровольцев при однократном и многократном приёме внутрь» (разрешение МЗ РФ № 600 от 21.10.2015 г.) в условиях стационара Государственного автономного учреждения здравоохранения Ярославской области «Клиническая больница № 2».

После скринингового обследования накануне дня исследования добровольцы находились в стационаре и утром следующего дня под контролем врача-исследователя 3 из 15 добровольцев принимали высшую дозу препарата — 15 мг (таблетки ГБ-115 0,001 г; серия препарата — 10314; производитель — ОАО «Дальхимфарм», Россия). 

Отбор образцов крови

Каждому добровольцу на 8 ч в локтевую вену устанавливали кубитальный катетер.

До приёма препарата, после установки катетера отбирали контрольную пробу крови (0 проба). Образцы крови (10,0 мл) отбирали и переносили в конические полиэтиленовые пробирки (предварительно обработанные К2ЭДТА). Отбор образцов крови для последующего определения содержания препарата в плазме крови осуществлялось в дискретные интервалы времени: через 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,5; 2,0; 4,0; 6,0 и 8,0 ч [3].

Пробоподготовка и количественное определение

Исследуемое вещество извлекали из плазмы крови методом осаждения белков. К 250 мкл плазмы крови, содержащей ГБ-115, прибавляли 750 мкл 0,5% раствора муравьиной кислоты в метаноле, тщательно перемешивали. Полученные суспензии центрифугировали при 9 000 g в течение 15 мин при температуре 4°C. Надосадочную жидкость переносили в хроматографические виалы.

Использовали жидкостной хроматограф Surveyor (Thermo scientific, США), оснащённый градиентным насосом, дегазатором, автосамплером, тандемным масс-селективным детектором QQQ Agilent 6460 (Agilent Technologies, США).

Хроматографическое разделение проведено на аналитической колонке Eclipse XDB-C18 (150 х 4,6 мм; 5 мкм), Agilent, США в режиме изократического элюирования. Подвижная фаза: раствор «А» (50 мл 0,1 М раствора аммония ацетата и 5 мл муравьиной кислоты до-водили водой деионизованной до общего объёма 1,0 л) и раствор «Б» (50 мл 0,1 М раствора аммония ацетата и 5 мл муравьиной кислоты доводили ацетонитрилом до общего объёма 1,0 л) смешивали в соотношении А:Б = 40:60 (об/об).

Скорость потока подвижной фазы — 0,6 мл/мин; объём вводимой пробы — 5 мкл; тип ионизации: электроспрей при атмосферном давлении (+); детектирование: режим множественных молекулярных реакций (MRM); анализируемые переходы: m/z 435,5—>159,0; энергия соударения — 17 эВ; температура капилляра 275 °С; напряжение на капилляре —3000 B.

Для расчёта концентраций ГБ-115 использовался метод абсолютной калибровки по площади пика ГБ-115. Площади пиков оценивались с помощью программы XCalibur (ver. 2.5.6.), Thermo scientific, США, в режиме автоматического интегрирования. Отмечена линейная зависимость между площадью хроматографического пика и концентрацией ГБ-115 в плазме крови в диапазоне 1—50 нг/мл. Предел количественного определения методики составил 1 нг/мл.

Методику валидировали по следующим параметрам: селективность, диапазон применения (верхний и нижний пределы количественного определения), линейность, правильность и прецизионность, стабильность.

Для расчётов фармакокинетических параметров был использован модельно-независимый метод [3].

В таблицах представлены средние арифметические значения величин (х), стандартные отклонения (SD), коэффициент вариации (C.V.%).

Все процедуры в исследовании выполнены согласно стандартным операционным процедурам (СОП) лаборатории фармакокинетики ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» и соответствующим нормативным актам.

Результаты и их обсуждение

Фармакокинетические исследования на крысах 

Хромато-масс-спектрометрический анализ всех образцов плазмы крови показал, что в анализируемых образцах присутствует характеристический молекулярный ион, соответствующий неизмененной молекуле ГБ-115.

На рис.1 представлена усредненная фармакокинетическая кривая ГБ-115 в плазме крови крыс после однократного перорального введения ГБ-115 в виде суспензии (доза 100 мг/кг). Поскольку на каждую временную точку использовали по 6 животных, результирующая фармакокинетическая кривая была построена по усреднённым концентрациям, поэтому при расчётах фармакокинетических параметров отсутствует статистическая обработка результатов. Как видно из рис. 1, ГБ-115 быстро всасывался из ЖКТ в системный кровоток и определялся в плазме крови уже через 5 мин после введения. Максимальная концентрация ГБ-115 в плазме крови крыс (146,16 нг/мл) достигалась через 0,17 ч (10 мин) после введения препарата. Соединение ГБ-115 достаточно быстро выводится из организма животных. Об этом свидетельствуют значения следующих фармакокинетических параметров: период полувыведения исследуемого вещества составил 0,24 ч, а среднее время удерживания (MRT) ГБ-115 в организме животных — 0,28 ч. При этом величина плазменного клиренса (Cl/F) исследуемого вещества составила 2,11 л/ч/кг (табл. 2).

Параметром, характеризующим степень проникновения лекарственного вещества в ткани, является кажущийся объём распределения (Vd/F). Его величина составила 0,74 л/кг. Кажущийся объём распределения обычно не эквивалентен анатомическому объёму, а отражает распределение препарата и степень его связывания в организме. Так, если препарат связывается преимущественно белками крови, Vd/F будет меньше, чем реальный. С другой стороны, преимущественное связывание препарата во внесосудистом пространстве приводит к превышению значения Vd/F над реальным. В нашем случае расчёт величин Vd/F дал значительно большие результаты, указывающие, что ГБ-115 распределяется во всех жидких средах организма животных [9].

На рис. 2 представлен усредненный фармакокинетический профиль ГБ-115 в плазме крови кроликов после однократного перорального введения субстанции в дозе 100 мг. Тестируемое вещество определялось в биожидкости на протяжении 4 ч. Снижение концентраций ГБ-115 после достижения максимальных концентраций носило монофазный характер.

В табл. 3 представлены основные фармакокинетические параметры ГБ-115 у кроликов после однократного введения внутрь субстанции. Время наступления максимальной концентрации анализируемого вещества в плазме крови (Tmax) составило 0,71 ± 0,10 ч. Уровень максимальной концентрации в плазме крови животных (Cmax) в среднем составил 191,50 ± 39,16 нг/мл. При этом среднее значение константы скорости элиминации (kel) ГБ-115 из плазмы крови кроликов составило 0,548 ± 0,133 ч-1, а период полуэлиминации (ti/2el) ГБ-115 из плазмы крови — 1,32 ± 0,30 ч. MRT ГБ-115 в организме животных равнялось 1,65 ± 0,38 ч.

На рис. 3 представлены индивидуальные фармакокинетические профили ГБ-115 в плазме крови добровольцев после однократного перорального приёма таблеток ГБ-115 в дозе 15 мг.

Из рис. 3 видно, что снижение концентраций исследуемого лекарственного вещества после достижения пиковых значений имеет монофазный характер. ГБ-115 определялся в плазме крови всех 3 добровольцев в течение 6 ч после приёма препарата.

В табл. 4 представлены фармакокинетические параметры ГБ-115 в плазме крови добровольцев после однократного приёма таблеток ГБ-115 в дозе 15 мг.

Анализ фармакокинетических параметров показал, что ГБ-115 всасывался в системный кровоток из ЖКТ добровольцев с разной скоростью. Параметр, характеризующий скорость всасывания препарата в системный кровоток Cmax/AUC0-T, изменялся от 0,4838 до 0,6477 ч—1. При этом время достижения Cmax — Tmax ГБ-115 в плазме крови изменялось от 0,75 до 2,0 ч и в среднем составило 1,42 ± 0,63 ч.

Величины Cmax изменялись от 29,72 до 55,89 нг/мл (44,02 ± 13,25 нг/мл).

ГБ-115 достаточно быстро выводится из плазмы крови. Так, период полувыведения (t1/2el) исследуемого вещества колебался от 0,83 ч до 1,17 ч и в среднем составил 0,98 ± 0,17 ч. Быстрое выведение препарата из организма характеризуется также величиной MRT. Величина данного параметра изменялась от 1,56 ч до 2,38 ч (2,04 ± 0,43 ч).

Общий плазменный клиренс (Cl/F) ГБ-115 находился в диапазоне значений 1,367—3,734 л/ч/кг (2,643 ± 1,194 л/ч/кг).

Параметром, характеризующим степень проникновения лекарственного вещества в ткани, является кажущийся объём распределения (Vd/F). Его величина для ГБ-115 после перорального введения в дозе 15 мг составила в среднем 3,60 ± 1,42 л/кг (2,31—5,12 л/кг).

Представляется целесообразным сравнить фармакокинетические характеристики ГБ-115 у животных разных видов и человека. Причём, следует сравнивать параметры, которые не зависят от введённой дозы, поскольку исследуемые дозы у животных и добровольцев отличались друг от друга на два порядка (100 мг/кг — для крыс и около 0,2 мг/кг — для добровольцев). Прямое сопоставление полученных значений, на наш взгляд, некорректно, поскольку отсутствует доказательство линейной зависимости фармакокинетики ГБ-115 в этом диапазоне доз.

Рассчитанные дозонезависимые фармакокинетические параметры у крыс, кроликов и человека после перорального введения ГБ-115 представлены в табл. 5.

При сравнении этих параметров ГБ-115 у крыс и кроликов выявлены межвидовые различия.

Так, параметр, характеризующий скорость всасывания препарата Cmax/AUC0-T из ЖКТ крыс в среднем составил 3,0794 ч—1 и для кроликов — 0,5201 ч—1. Таким образом, ГБ-115 всасывался в системный кровоток крыс в 6 раз быстрее, чем у кроликов. Выведение препарата из плазмы крови крыс и кроликов также происходило с различными скоростями (для крыс t1/2el — 0,24 ч и для кроликов — 1,32 ч, MRT — 0,28 и 1,65 ч, соответственно). Об этом также свидетельствуют величины kel. Так, данный параметр у крыс составил 2,8424 ч-1, у кроликов — 0,5481 ч-1. Другими словами, выведение ГБ-115 из организма кроликов происходило в 5 раз медленнее, чем у крыс.

Фармакокинетические параметры ГБ-115, рассчитанные для добровольцев значительно отличалась от таковых, полученных для крыс. В то же время, при сравнении параметров, полученных у добровольцев и кроликов выявлены незначительные расхождения. Исследуемое соединение всасывалось из ЖКТ в системный кровоток у кроликов и добровольцев с одинаковой скоростью (0,5201 и 0,5275 ч-1, соответственно). Среднее значение kel у добровольцев была на 30% выше аналогичного параметра у кроликов.

t1/2el ГБ-115 из плазмы крови добровольцев составил 0,98 ч, что на 30% меньше, чем у кроликов (1,32 ч). Аналогичная зависимость прослеживается при сопоставлении значений MRT добровольцев, крыс и кроликов.

После однократного перорального введения Cmax ГБ-115 в плазме крови крыс регистрировались через 0,17 ч, у кроликов - 0,71 ч и через 1,42 ч - у добровольцев.

Заключение 

Выявлены существенные межвидовые различия в фармакокинетике ГБ-115 после его перорального введения/приёма у крыс, кроликов и человека. Так, дозонезависимый параметр - константа скорости элиминации уменьшалась в ряду: крыса > человек > > кролик. Период полувыведения ГБ-115, напротив, возрастал в ряду: крыса < человек < кролик.