Введение

Один из актуальных подходов к созданию препаратов с нейропсихотропной активностью базируется на современных представлениях о механизмах эндогенного регулирования функций нейронов и их регенерации. Среди известных эндогенных регуляторных белков особое внимание уделяется факторам роста нервной ткани, в частности, нейротрофинам и среди них фактору роста нервов (ФРН, nerve growth factor, NGF). ФРН участвует в росте, созревании и поддержании жизнедеятельности нейронов в центральной и периферической нервной системе как в норме, так и при патологии [1]. Известно вовлечение ФРН в патогенез болезней с нейродегенерацией, в частности, болезни Альцгеймера (БА), болезни Паркинсона (БП), инсультов и др. [2]. Показана эффективность ФРН в клинике у больных [3] и в экспериментальных исследованиях [4, 5]. Вместе с тем, терапевтическое использование самого ФРН ограничивается его нестабильностью в биологических жидкостях, плохой способностью проникать через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), возможностью иммунной реакции, наличием побочных эффектов за счёт его плейотропности. Актуальным подходом к регуляции системы факторов роста нервной ткани в ЦНС является создание (конструирование и синтез) низкомолекулярных миметиков факторов роста, взаимодействующих с соответствующими тирозинкиназными рецепторами [6].

В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» в течение нескольких десятилетий проводятся исследования по созданию и изучению механизмов действия нейропсихотропных лекарственных препаратов, в частности, с нейропротекторной активностью. Была сформулирована оригинальная гипотеза о возможности конструирования фармакологически активных дипептидов на основе петлеобразных структур белков, определяющих рецепторное взаимодействие [7]. Определено, что фармакофорными участками нейротрофина являются их бета-изгибы (последовательность из четырёх аминокислотных остатков с бета-поворотной конформацией) и созданы дипептидные миметики факторов роста [8]. В опытах на животных выявлены нейропротекторные свойства дипептидного миметика 4-й петли фактора роста нервов крысы [9]. Другой низкомолекулярный димерный дипептидный миметик 4-й петли фактора роста нервов человека гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-глицил-лизина), ГК-2h в исследованиях проявил нейропротективные свойства как in vitro [10], так и на экспериментальных моделях БА и инсультов в опытах на крысах [11].

Целью исследования явилось изучение общего спектра фармакологической активности димерного дипептидного миметика фактора роста нервов человека гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-глицил-лизина), ГК-2h, в опытах на животных. В задачи исследования входило изучение эффектов соединения, характерных для нейропсихотропных препаратов, а именно выявление антиамнестических свойств, противогипоксической, противосудорожной, антидепрессивной активности, оценка влияние соединения на двигательную активность и ориентировочно-исследовательское поведение животных.

Материалы и методы исследования

Исследование фармакологической активности соединений проводилось в опытах с использованием стандартных методов, применяемых для скрининга и изучения механизмов действия нейропсихотропных препаратов, согласно международным стандартам [12, 13]

Соединения. В исследовании были использованы: оригинальный димерный дипептидный миметик 4-ой петли ФРН человека — гексаметилендиамид бис-(М-моносукцинил-глицил-лизина) — ГК-2Й, синтезированный в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»; блокатор мускаринового типа холинергических рецепторов — скополамин (Sigma); антагонист NMDA-рецепторов — кетамин (Sigma).

Животные. Эксперименты проводились на беспородных мышах-самцах, мышах инбредной линии C57BL/6 массой 20—23 г, беспородных крысах самцах, массой 180—200 г. Экспериментальные животные получены из питомника лабораторных животных «Столбовая», Московская область. Животные содержались в соответствии с правилами лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 351.000.3-96 и Р 51000.4-2011), приказу МЗ РФ № 708н от 23.08.2010 г.

Методы

Антиамнестическое действие соединения оценивали на модели амнезии УРПИ в установке Passive avoidance фирмы Lafayette Instrument Co (США). Регистрировали латентное время захода животного в тёмную камеру при воспроизведении рефлекса через 24 ч после обучения (неизбегаемый удар током в тёмной камере установки в течение 10 с). Амнезию УРПИ у крыс вызывали максимальным электрошоком (МЭШ), проводимым после обучения через корниальные электроды (I = 43 мА, частота 50 Гц, продолжительность 0,3 с), скополамином (1,5 мг/кг) или кетамином (10,0 мг/кг), каждый из которых вводили внутрибрюшинно (в/б) за 15 мин до обучения. ГК-2Й использовали в/б однократно или повторно за 40 мин до тестирования. Животные контрольных групп получали дистиллированную воду в эквивалентном объёме.

Противогипоксическое действие соединения оценивали в опытах на мышах на моделях гипоксии с гиперкапнией в гермообъёме, помещая животных в герметически закрываемые банки объёмом 200 см3. Регистрировали время гибели животных.

Для моделирования судорожных состояний использовался тест МЭШ для мышей. С помощью прибора Rodent shocker Type 221 фирмы Harvard apparatus GmbH (Германия) через корнеальные электроды животное получало электрический стимул (10-12 mA, 250 V, длительностью 0,2 с), вызывающий у 40-50% контрольных мышей тоническую экстензию задних конечностей. Регистрировались подергивания (1 балл), клонические судороги (2 балла), тоническая экстензия (3 балла) и гибель мышей (4 балла).

Депрессивноподобное поведение вызывали у мышей с использованием теста вынужденного плавания по Порсолт [14] и теста подвешивания за хвост [15] в опытах на мышах.

Исследование ориентировочно-исследовательского поведения и двигательной активности у животных проводилось в открытом поле размером 60 х60 см с полом равномерно разделённым линиями на 9 квадратов с 16 отверстиями диаметром 4 см для крыс и размером 40 х40 см с полом разделенным линиями на 9 квадратов с 16 отверстиями диаметром 2 см для мышей. Регистрировалась вертикальная (число подъёмов на задние лапы) и горизонтальная (число пересечений линий квадратов) двигательная активность и количество заглядываний в отверстия.

Статистическую обработку результатов проводили с определением среднего значения и стандартной ошибки среднего значения, которые представлены в итоговых таблицах. Использовался пакет статистических программ Statistica 6.0 (StatSoft, USA). Различия определялись как статистически значимые при уровне p < 0,05. Для определения статистической значимости различий между группами использовали ранговый однофакторный анализ Kruskal-Wallis. Если различия были достоверны (p<0,05), проводилось попарное сравнение по непараметрическому критерию U Mann-Whitney, Стьюденту, а при анализе альтернативной формы учёта использовался точный метод Фишера (пакет программ Biostat).

Результаты и обсуждение

Изучение антиамнестических свойств ГK-2h на моделях амнезии УРПИ, показало, что МЭШ, скополамин в дозе 1,5 мг/кг или кетамин в дозе 10 мг/кг вызывали у крыс амнезию условной реакции пассивного избегания (УРПИ). Это характеризовалось по сравнению с контролем уменьшением латентного времени рефлекса при воспроизведении через 24 ч после обучения (рис. 1).

На модели амнезии УРПИ, вызванной МЭШ, показано, что ГК-2h в дозах 0,1; 0,3; 0,6; 1,0 и 2,0 мг/кг не оказывал влияния на формирование УРПИ, а в дозе 1,5          мг/кг ГК-2h существенно увеличивал латентное время при воспроизведении рефлекса (рис. 1). На модели амнезии УРПИ, вызванной скополамином, наиболее отчётливо эффект ГК-2h выявлялся при использовании соединения в дозах 0,5 и 1,0 мг/кг, в дозе 0,1 мг/кг наблюдалась тенденция увеличения латентного времени рефлекса. Вместе с тем, при повторном 5-дневном предварительном введении крысам ГК-2h в дозе 0,1 и 0,5 мг/кг регистрировался сильный антиамнестический эффект, характеризующийся полным восстановлением памятного следа. На модели амнезии УРПИ, вызванной кетамином, антиамнестический эффект ГК-2h выявлялся в дозе 1,0 мг/кг при 5-дневном введении (рис. 1).

Таким образом, TK-2h в диапазоне доз от 0,1 до 1,5 мг/кг обладает антиамнестическими свойствами на моделях амнезии УРПИ, вызванной МЭШ, скополамином или кетамином. Изучение противогипоксического действия ГК-2h осуществлялось на модели гипоксии с гиперкапнией в гермообъёме. Противогипоксический эффект ГК-2h выявлен в дозе 1,0 мг/кг при 5-дневном введении в опытах на мышах линии С57Bl6 (табл. 1).

Исследование противосудорожных свойств ГК-2h на модели судорожных реакций, вызванных МЭШ, в опытах на мышах линии С57В16 показало, что в дозах 0,1, 0,5, 1,0 и 2,0 мг/кг соединение не способно предупреждать различные проявления судорожных реакций. Лишь в дозе 1,5 мг/кг отмечалось статистически достоверное ослабление судорожных реакций (табл. 2).

Изучение влияния вещества на депрессивноподобное поведение показало, что в тесте Порсолт в дозе 0,1 мг/ кг и в тесте подвешивания за хвост в дозах 0,1 и 1,0 мг/ кг ГК-2h не оказывал влияния на поведение животных, а в дозе 1,0 мг/кг при предварительном 5-дневном введении у мышей наблюдалась тенденция уменьшения времени иммобилизации при плавании (табл. 3).

Изучение поведения животных в открытом поле. ГК-2h в дозах 0,1 и 1,0 мг/кг при субхроническом 3-дневном введении не оказывал влияния на ориентировочно-исследовательское поведение и двигательную активность мышей в открытом поле (табл. 4).

Ранее было показано, что замещённый димерный дипептидный миметик 4-й петли фактора роста нервов человека ГК-2h, синтезированный как соединение, способное воспроизводить его эффекты, обладает нейропротекторными свойствами на моделях патологий, в механизме которых участвует ФРН.

Показано, что в диапазоне доз от 0,1 до 1,0 мг/кг при повторном введении rK-2h на моделях БА ослабляет у крыс нарушения пространственной ориентации и памяти, а на моделях инсультов — обладает способностью увеличивать выживаемость, ослаблять неврологический дефицит, улучшать поведение и память. Нейропротекторный эффект соединения выявлен и при морфометрических исследованиях [11]. В результате проведённой работы по изучению общего спектра фармакологической активности ГК-2h в опытах на мышах и крысах показано, что соединение в используемых дозах и режимах введения обладает антиамнестическиими свойствами на моделях амнезии УРПИ, вызванной скополамином, МЭШ или кетамином, умеренным противогипоксическим и слабым противосудорожным эффектами, не влияет на ориентировочно-исследовательское поведение и двигательную активность животных в открытом поле. Особенно отчётливо выявляются антиамнестические свойства ГK-2h, что согласуется с полученным ранее мнемотропным эффектом нового соединения на моделях БА, инсультов [11]. Результаты настоящей работы подтверждают возможность использования методов скрининга нейропсихотропных препаратов, а именно, моделей амнезий УРПИ и гипоксий для первичной оценки и прогнозирования нейропротекторных свойств нейропептидов. Следует отметить, что эти эффекты соединения выявляются практически в том же диапазоне доз, что и его нейропротекторные свойства.

Выводы

1. ГK-2h в дозах 0,1; 0,5 и 1,0 мг/кг в/б обладает антиамнестическими свойствами на модели амнезии условной реакции пассивного избегания, вызванной скополамином; в дозе 1,5 мг/кг, вызванной максимальным электрошоком, а при использовании соединения в дозе 1,0 мг/кг/5 дней на модели кетаминовой амнезии, увеличивая у крыс латентное время при воспроизведении рефлекса.

2. ГK-2h в дозе 1,5 мг/кг, в/б при различных режимах введения обладает противогипоксическим эффектом в условиях гипоксии с гиперкапнией в гермообъёме и слабым противосудорожным действием на модели судорог, вызванных максимальным электрошоком, не влияет на ориентировочно-исследовательское поведение животных в открытом поле.