Введение

К наиболее распространённым хроническим нейроваскулярным заболеваниям относится мигрень, которая поражает от 11 до 30% населения разных стран в наиболее работоспособном возрасте. В современном мире количество пациентов с данным заболеванием ежегодно растёт, а имеющиеся в распоряжении неврологов фармакологические препараты не лишены существенных побочных эффектов [1, 7, 8, 10].

В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» разработано лекарственное средство из группы производных оксима тропинона, обладающее противомигренозной антисеротониновой активностью — тропоксин [2—4]. При создании новых лекарственных средств необходимым этапом является изучение их фармакодинамики и фармакокинетики на доклиническом уровне. Результаты этих исследований в ряде случаев позволяют установить взаимосвязь между ними, что в дальнейшем может быть использовано для переноса данных с животных на человека.

Поэтому целью настоящей работы явилось изучение фармакодинамики и фармакокинетики тропоксина у крыс и выявление взаимосвязей между ними.

Материалы и методы

По химическому строению молекула тропоксина представляет собой 3-(3,4,5-триметоксибензоилокси- имино)-8-метил-8-азабицикло- [1, 2, 3] октана гидрохлорид. В работе использована субстанция тропоксина, синтезированная в опытно-технологическом отделе ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова».

Фармакодинамику и фармакокинетику тропоксина после внутривенного (в/в) введения изучали на нелинейных крысах-самцах, полученных из питомника «Столбовая» (Московская область). Животных содержали в условиях вивария ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» при 12-часовом световом режиме, на стандартной диете. Все эксперименты с животными проводили в соответствии с международными правилами (Директива 86/629/ЕЕС) и правилами работы с животными, утверждёнными этической комиссией ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова».

Фармакологические свойства тропоксина изучали на 30 наркотизированных (хлоралгидрат 350—400 мг/кг, внутрибрюшинно) нелинейных крысах массой 250-300 г.

Состояние мозгового кровообращения у животных оценивали с помощью ультразвукового флоуметра и лазерного допплеровского флоуметра фирмы «Transonic System Inc.» (США). Одновременно в экспериментах регистрировали изменения артериального давления в бедренной артерии. Запись показателей кровотока и артериального давления производили на полиграфе «BIOPAK» США, соединённым с персональным компьютером [5].

Для изучения антисеротониновых свойств исследуемых веществ в работе оценивали констрикторные реакции внутренней сонной артерии у наркотизированных крыс в условиях искусственной вентиляции лёгких в ответ на введение серотонина (5НТ, 20 мкг/кг, в/в; «Sigma Aldrich», ФРГ) или избирательного агониста 5НТ2В/2С-рецепторов мета-хлорфенилпиперазина (0,1 мг/кг, «Sigma Aldrich», ФРГ).

Тропоксин вводили в/в в дозе 10 мг/кг, что соответствует примерно 10% его ЛД50 (78мг/кг). Исследуемые вещества вводили в бедренную вену животных.

Фармакокинетику тропоксина после в/в введения изучали на нелинейных крысах-самцах массой 200±20 г. Содержание тропоксина определяли в плазме крови крыс через 0,0; 0,33, 0,5, 0,66, 0,83, 1,0, 1,33, 1,5, 2, 4, 6 и 7 ч после введения препарата.

Отбор образцов крови производили в пробирки, обработанные ЭДТА. Плазму крови немедленно отделяли центрифугированием при 2 500 об/мин в течение 10 мин. Плазма крови отбиралась пипеткой в пластиковые криопробирки и замораживалась при температуре не выше —18 °C.

Для определения тропоксина в биоматериале разработана и валидирована методика высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием, позволяющая после жидкость-жидкостной экстракции детектировать 2,5 нг/мл исследуемого вещества. Методика была линейна в диапазоне 5—1000 нг/мл. Степень извлечения тропоксина из плазмы крови составила в среднем 82,06±5,36%.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программ «Biostat» и «Stаstistika» v. 8.0 («Statistika Inc.», США). Средние данные в тексте представлены в виде медианы или средней арифмети-ческой и её стандартной ошибки (M±m). Результаты рассматривали как значимые при p≤0,05.

Результаты и обсуждение

Цереброваскулярная антисеротониновая активность тропоксина

Проведённые опыты позволили установить, что серотонин (20 мкг/кг, в/в) в большинстве случаев на первой минуте после введения вызывает уменьшение объёмной скорости мозгового кровотока в системе внутренней сонной артерии в среднем на 40,0% (л=10). Через 5—7 мин после инъекции 5НТ наблюдается восстановление исходного уровня мозгового кровотока. Уменьшение притока крови в мозг в большинстве опытов сопровождается понижением уровня артериального давления. Тропоксин (10 мг/кг, в/в) в этих условиях существенно ослабляет изменения, вызванные серотонином. Через 20, 30, 40 и 50 мин после введения тропоксина уменьшение притока крови в мозг под влиянием серотонина составляет 27,8%, 29,4%, 31,5% и 32,1%, соответственно (контроль: 40,0%; p≤0,05, рис. 1). К 60-й мин после введения тропоксина реакция мозгового кровотока на серотонин восстанавливается и составляет 41,8%.

В серии опытов изучали влияние тропоксина на введение агониста 5НТ2В/2С-рецепторов- m-CPP, который, согласно данным литературы [1, 6, 9], провоцирует приступ головной боли у больных мигренью, вызывает увеличение пропотевания альбуминов плазмы из менингеальных сосудов и активацию чувствительных волокон тригеминоваскулярной системы.

В опытах с использованием m-CPP было показано, что если до введения тропоксина агонист 5НТ2В/2С-рецепторов вызывает снижение мозгового кровотока во внутренней сонной артерии в среднем на 25%, то через 20 мин после введения тропоксина снижение кровотока под влиянием m-CPP составляет 19,2%, через 30 мин — 13,1%, через 40 мин — 11,3% и через 50 мин — 18,7% (p≤0,05, рис. 2). Затем к 60-й минуте реакция сосудов мозга на введение m-CPP даже несколько усиливается. При введении m-CPP артериальное давление кратковременно снижается в среднем на 33%, затем восстанавливается до значений, близких к исходным. Тропоксин не оказывает статистически значимого влияния на данную реакцию (см. рис. 2).

Далее в серии опытов m-CPP вводили крысам через 20 мин после тропоксина, и оказалось, что в этих условиях снижение мозгового кровотока под влиянием агониста 5НТ2В/2С-рецепторов составило только 6% (20 мин), 6,8% (30 мин), 7,5% (40 мин), 12% (50 мин), 17% (60 мин). Затем к 80-й минуте констрикторная реакция сосудов мозга под влиянием m-CPP постепенно восстанавливалась до реакции, наблюдаемой в контрольных опытах, и составила в среднем 27,5% (рис. 3). При этом тропоксин не оказывал статистически значимого влияния на реакцию артериального давления на m-CPP.

Фармакокинетика тропоксина

На рис. 4 представлен фармакокинетический профиль тропоксина в плазме крови крыс после однократного в/в введения в дозе 10 мг/кг.

Из рис. 4 видно, что снижение концентраций тропоксина в плазме крови крыс носит монофазный характер. Усредненный период полувыведения исследуемого соединения составил 1,34 ч.

Фармакодинамико-фармакокинетические взаимосвязи

Предпринята попытка оценить взаимосвязь между усредненными концентрациями тропоксина (фармакокинетическая переменная) в плазме крови и медианой изменения притока крови в мозг крыс (фармакодинамическая переменная) после однократного в/в введения тропоксина в дозе 10 мг/кг на фоне в/в введения серотонина и m-CPP. Изменение сравниваемых параметром регистрировали в течение 1,0 ч — 80 мин после введения препарата. На рис. 5—7 представлены полученные результаты.

Результаты, представленные на рис. 6 и 7, отличаются друг от друга тем, что в первом случае сначала крысам в/в вводили m-CPP, а затем тропоксин, а в последнем случае — сначала тропоксин, а через 20 мин — m-CPP.

Как видно из рис. 5 выявлена прямая зависимость между падением концентрации тропоксина в плазме крови крыс и изменениями мозгового кровотока на фоне введения серотонина (r=0,7295). Для агониста 5НТ2в/2С рецепторов — m-CPP такая зависимость не обнаружена, если сразу после m-CPP животным вводили тропоксин (рис. 6). Коэффициент корреляции линейного уравнения характеризовался значением 0,3442. В то же время выявлена взаимосвязь между изучаемыми параметрами в случае введения тропоксина через 20 мин после введения агониста 5НТ2В/2С рецепторов — рис. 7.

Выводы

1. Тропоксин в значительной степени ослабляет констрикторное влияние и серотонина, и агониста 5НТ2В/2С рецепторов на сосуды мозга крыс.

2. Выявлена прямая зависимость между падением концентрации тропоксина в плазме крови крыс и изменениями мозгового кровотока на фоне введения серотонина и в случае введения тропоксина через 20 мин после введения агониста 5НТ2В/2С рецепторов — метахлорфенилпиперазина.