Введение

Болезнь Паркинсона — распространённое нейродегенеративное заболевание, поиск средств патогенетический терапии которого остаётся крайне актуальным.

Гимантан — новый оригинальный препарат, созданный в НИИ фармакологии имени В.В. Закусова, обладает выраженной противопаркинсонической активностью, доказанной на экспериментальных моделях [1—3], и подтверждённой в клинике у больных с начальными стадиями болезни Паркинсона [4].

Установлен комплексный механизм действия гимантана. Препарат оказывает влияние на несколько известных звеньев патогенеза болезни Паркинсона. Гимантан модулирует дофаминергическую нейропередачу [5], является блокатором ионных каналов глутаматных рецепторов NMDA подтипа [6], ингибирует МАО-В [7], обладает противовоспалительной активностью [8].

Одной из установленных причин прогрессирующей гибели дофаминергических нейронов при болезни Паркинсона являются повреждения, вызванные оксидативным стрессом. Подтверждение роли свободных радикалов в развитии нигральной дегенерации при БП получено в экспериментальных исследованиях и при изучении чёрной субстанции умерших от болезни Паркинсона, где установлено наличие как оксидативного стресса (снижение уровня глутатиона), так и оксидативных повреждений (увеличение перекисного окисления липидов и повреждений ДНК) [9].

Цель исследования

Целью настоящего исследования явилась оценка эффектов гимантана на уровень продуктов перекисного окисления липидов в структурах головного мозга на двух моделях паркинсонического синдрома — у мышей C57BL/6 c МФТП-индуцированным ПС и крыс с 6-ГОДА индуцированным ПС.

Методы

Моделирование паркинсонического синдрома у мышей линии С57BL/6 проводили путём системного введения МФТП. Эксперименты проводили на мышах-самцах линии C57BL/6 массой 20—22 г. МФТП вводили в дозе 20 мг/кг один раз в сутки 5 дней. Гимантан 10 мг/кг вводили внутрибрюшинно 5 дней до начала введения МФТП, затем вместе с МФТП. Животным контрольных групп вводили по этой схеме только физиологический раствор, МФТП и физиологический раствор или физиологический раствор и гимантан. Животных декапитировали через 24 ч после последней инъекции и извлекали стриатум и фронтальную кору.

Паркинсонический синдром у крыс вызывали введением нейротоксина 6-ГОДА (12 мкг) в средний переднемозговой пучок (MFB) левого полушария головного мозга по стереотаксическим координатам. Контрольную группу животных (ложно оперированные животные) подвергали такой же операции с введением физиологического раствора. Через 15 дней после введения 6-ГОДА отбирались животные со сформировавшимся паркинсоническим синдромом по результатам тестирования в тесте «цилиндр», позволяющем выявить нарушения двигательной функции на контралатеральной стороне введения нейротоксина конечности [10]. Отобранные животные были разделены на 2 группы, которым на протяжении 21 дня ежедневно внутрь вводили гимантан в дозе 10 мг/кг или физиологический раствор. На 21-й день животных декапитировали, извлекали структуры мозга — фронтальную кору и стриатум.

Определение продуктов пероксидации липидов в гомогенатах структур мозга мыши. Гомогенат (5% масса/объём) готовили из точных навесок ткани соответствующей структуры мозга и 19 объёмов забуференного фосфатом физиологического раствора, содержащего 0,1 ммоль/л ионола (Fluka, Швейцария) при помощи ультразвукового дезинтегратора УЗДГН-1 при 22 кГц в течение 5 с при температуре 0 °С.

Определение диеновых конъюгатов (ДК). К 50 мкл гомогената добавляли 1 000 мкл смеси для экстракции (н-гептан-пропанол-2 = 1:1, по объёму). Образцы интенсивно встряхивали 2 раза по 10 сек на встряхивателе типа Вортекс. Образцы центрифугировали при 3 000 об/мин в течение 10 мин. К 900 мкл супернатанта добавляли 100 мкл воды для разделения фаз и интенсивно встряхивали 2 раза по 10 с и центрифугировали при 3 000 об/мин в течение 10 мин. Отбирали по 300 мкл верхней гептановой фазы и добавляли по 1 200 мкл 95% этанола. Оптическую плотность образцов определяли на спектрофотометре DU-50 (Beckman-Coulter, США) в полумикрокювете при 233 нм. Расчёт количества ДК проводили на осно-вании значения коэффициента молярной экстинкции 2,2 х 105M-1cm-1. Все измерения проводили в 3 параллелях.

Определение малонового диальдегида (МДА). К 50 мкл гомогената добавляли 20 мкл 0,485 М соли Мора и инкубировали при 37 °С в течение 30 мин. Затем к образцам добавляли 1 030 мкл 0,9% раствора 2-тиобарбитуровой кислоты (Serva, Германия) в 50% уксусной кислоте, интенсивно встряхивали и инкубировали при 80 °С в течение 60 мин. После охлаждения измеряли оптическую плотность образцов на спектрофотометре DU-50 (Beckman-Coulter, США) в полумикрокювете при 532 нм. Расчёт количества МДА проводили на основании значения коэффициента молярной экстинкции 1,56 х 105M-1cm-1. Все измерения проводили в 3 параллелях

Результаты

Введение МФТП в дозе 20 мг/кг один раз в сутки в течение 5 дней вызывало достоверное повышение уровня МДА и ДК в стриатуме и ДК в коре мышей линии C57BL/6 по сравнению с группой, которой вводился физиологический раствор.

Предварительное до МФТП (5 дней) и затем на фоне МФТП (5 дней) введение гимантана в дозе 10 мг/кг в сутки предотвращало повышение уровня продуктов ПОЛ в исследованный структурах. Уровни МДА и ДК в стриатуме и МДА в коре были достоверно ниже по сравнению с группой животных, которым вводился только нейротоксин МФТИ (табл. 1).

На модели индуцированного 6-ГОДА ИС было зарегистрировано достоверное увеличение уровня МДА в обеих изученных структурах головного мозга крыс как на стороне введения 6-ГОДА, так и на контралатеральной стороне (рис. 1). Содержание ДК было достоверно выше во фронтальной коре и левом стриатуме по сравнению с группой ложно оперированных крыс (рис. 2).

У животных, которым вводили гимантан 10 мг/кг в течение 21 дня, уровень МДА в стриатуме и фронтальной левой коре был достоверно ниже, чем у не-леченных (см. рис. 1), а содержание ДК ниже во всех изученных структурах по сравнению с группой крыс, у которых развивался 6-ГОДА индуцированный ИС без лечения гимантаном (см. рис.2).

Механизмы нейротоксического действия 6-ГОДА и МФТИ включают образование активных форм кислорода (АФК), вызывающих каскад процессов, приводящих к развитию апоптоза [11, 12].

Результаты проведённых исследований свидетельствуют о том, что гимантан в эффективной дозе 10 мг/кг при двух режимах введения (5 дней до нейротоксина МФТП и совместно с ним в течение 5 дней, а также при введении в течение 21 дня) на фоне развивающегося 6-ГОДА индуцированного ПС способен ослаблять вызываемую нейротоксинами активацию ПОЛ. Полученные данные согласуются с ранее установленными антиоксидантными свойствами гимантана в бесклеточной среде [3].

К настоящему времени накоплен большой объём научных данных, подтверждающих, что воспаление, митохондриальная дисфункция, образование свободных радикалов и оксидативный стресс, нарушение защиты нейротрофическими факторами вносят вклад в развитие дегенерации нигростриатных нейронов. Роль каждого из факторов доказана, однако первостепенность какого-либо из них не определена до сих пор. Поэтому наиболее адекватным подходом к разработке средств предупреждения или замедления развития заболевания, т. е. нейропротекторных препаратов, является поиск препаратов с поликомпонентным механизмом действия или подбор комбинаций препаратов, влияющих на ключевые звенья процесса нейродегенерации. Наличие антиоксидантной активности в спектре эффектов гимантана подтверждает перспективность его дальнейшего изучения в качестве средства патогенетической терапии болезни Паркинсона.