Введение

Ион лития характеризуется нормотимическим действием. Наиболее известной фармакологической формой лития является карбонат лития, использующийся в психиатрии для терапии биполярных расстройств [1], маниакального синдрома, игромании [2] и др. Однако препараты на основе карбоната лития имеют существенные недостатки.

Во-первых, для результативного и безопасного применения этих препаратов требуется регулярно измерять концентрацию лития в крови, что влечёт за собой дополнительные инвазивные процедуры [3]. Во-вторых, для карбоната лития характерен узкий терапевтический коридор концентраций лития в плазме — 0,6—1,2 ммоль/л. Концентрации Li+ в 1,5—2,5 ммоль/л ассоциированы со слабой токсичностью, 2,5—3,5 ммоль/л — с тяжёлым отравлением, а превышение порога в 3,5 ммоль/л может быть опасным для жизни [4]. В-третьих, для достижения искомого терапевтического эффекта в психиатрии необходимо использование значительных дозировок карбоната лития (1—3 г/сут, в остром периоде — до 9 г/сут), что ввиду высокой токсичности карбоната лития снижает привлекательность этой соли лития для назначения врачами [5].

Исходя из вышеизложенного, для повышения безопасности литиевой терапии исследуются эффекты других солей лития. В частности, аскорбат лития характеризуется низкой токсичностью (5й класс, LD50—6 334 мг/кг, токсичность в 8,4 раза меньше, чем у карбоната лития) [6]. В то же время психоневрологическая эффективность аскорбата лития достигается при более низких дозировках (в 10—20 раз меньше суточной дозы карбоната лития) [7]. Установлены анксиолитический, антидепрессивный [8], нейропротекторный [9] и мнестический эффекты аскорбата лития [10].

В настоящей работе было проведено комплексное экспериментальное исследование фармакокинетики аскорбата лития в дозе 1 000 мкг/кг. Полученные результаты позволяют утверждать, что препарат, созданный на основе аскорбата лития, будет достигать искомого терапевтического эффекта на существенно более низких дозировках, чем карбонат лития.

Материалы и методы

Эксперимент был проведён в соответствии с действующим Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств [11].

В качестве модельного объекта были использованы самцы белых крыс линии Вистар массой 200—250 г (n = 54, 9 групп по 6 животных в каждой). Животных содержали в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP) и приказом МЗ и СР РФ № 708н от 23.08.2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики» при естественном освещении и температуре воздуха около 20—22 °С в пластиковых клетках группами по 6 крыс в каждой, при свободном доступе к пище (стандартный брикетированный корм) и воде, при нормальном 12часовом световом режиме. Во избежание влияния суточных ритмов на поведенческие параметры животных все эксперименты проводились в период между 9 и 14 часами; исследование проводилось в рамках диссертационного исследования в соответствии с решением этического комитета ИвГМА от 24 марта 2016 г.

Приготовление растворов

Зондирование проводилось раствором аскорбата лития, 1 мл которого содержал 250 мкг элементного лития. Для получения дозы 1 000 мкг/кг животному массой 250 г необходимо получить 250 мкг элементного лития, т. е. 1 мл раствора. Необходимый объём раствора рассчитывался исходя из массы животного. Для приготовления раствора использовался порошок дигидрата аскорбата лития. Молекулярная масса безводного аскорбата лития — 178 г/моль, дигидрата аскорбата лития — 214 г/моль. В дигидрате аскорбата лития, литий и аскорбатанион представлены в молярном соотношении 1:1, а в массовом соотношении 1:71,33. Таким образом, 250 мкг элементного лития содержится в 250 х 71,33 = 17,84 мг дигидрата аскорбата лития.

Проведение эксперимента

Проводилось зондирование раствором аскорбата лития в дозе 1 000 мкг/кг (в расчёте на элементный литий). Выбор данной дозировки обусловлен тем, что эффекты органических форм лития достоверны уже при дозах в 30—100 мкг/кг (при приёме в течение 1—3 мес) [12]. Для исследования фармакокинетики и распределения лития в тканях было решено использовать однократное введение 10кратной дозы от 100 мкг/кг, т. е. 1 000 мкг/кг. Так как LD50 аскорбата лития составляет 6 334 мг/кг [6], то доза в 1 000 мкг/кг элементного лития достаточно далека от остротоксичной. Пробы крови и органы отбирали после эвтаназии животных с помощью цервикальной дислокации в 9 временных точках: 0 мин, 45 мин, 1 ч, 1,5 ч, 3 ч, 6 ч, 12 ч, 24 ч, 48 ч. Методом массспектрометрии определялись уровни лития в 11 различных биосубстратах: цельная кровь, головной мозг, лобная доля головного мозга, сердце, аорта, лёгкие, печень, почки, селезёнка, надпочечники, бедренная кость.

Определение уровней аскорбата лития

При определении уровней лития были получены гомогенаты тканей, исследованных биосубстратов. Образцы гомогенатов отбирались в пластиковые пробирки и разбавлялись в 5 раз бидистиллированной и деионизированной водой. При проведении массспектрометрии в качестве внутреннего стандарта в растворы вводили индий в концентрации 25 мкг/л. Калибровочные растворы были приготовлены из стандартных растворов фирмы VTRC с известным содержанием в диапазоне от 5—1000 мгк/л (10—7%). Полученные растворы анализировались на массспектрометре с ионизацией в индуктивно связанной плазме «Plasma Quad PQ2 Turbo» (VG Elemental, Англия). Рабочая мощность СВЧ генератора была 1,3 кВт. Расход плазмообразующего газа (аргон) 14 л/мин, расход транспортирующего газа 0,89 мл/ мин. Проводилось от 3 до 10 экспозиций каждого образца, время интегрирования сигнала составило 60 с. Данный метод признан наиболее точным и производительным и позволяет с высокой точностью проводить количественный анализ содержания 68 элементов периодической системы Д.И. Менделеева (в т. ч. лития) в различных биосубстратах.

Фармакокинетический анализ

В ходе настоящего анализа были использованы методы многокамерного и бескамерного фармакокинетического анализа. Многокамерный анализ проводился посредством пакета SimBiology в составе программного комплекса MATLAB2016 [13], а бескамерный анализ — с использованием электронных таблиц Excel, дополненных модулями программного пакета PKSolver [14].

Результаты и обсуждение

В результате проведения эксперимента были получены фармакокинетические кривые (ФК-кривые, т. е. зависимости концентраций от времени) для гомогенатов тканей различных органов, представленные на рис. 1.

ФК-кривые, полученные для различных биосубстратов, существенно отличаются по характеру и степени изменения концентраций лития во времени. Оценка «расстояния» между данными кривыми как среднеквадратичного отклонения кривых друг от друга позволило произвести кластеризацию ФК-кривых с использованием метода анализа метрических сгущений [15].

В результате кластеризации было установлено, что все ФК-кривые, за исключением ФК-кривых для печени, сердца и бедренной кости образуют единственный кластер. Данные приведены на рис. 2.

Визуальный анализ ФК-кривых показывает, что в течение 1—2 ч после зондирования аскорбатом лития происходит интенсивное накопление лития во всех исследованных тканях. Максимальные пиковые концентрации лития (Cmax) отмечены именно в гомогенатах тканей печени и сердца, а минимальные — в гомогенатах лёгких и аорты.

Важно отметить, что концентрации лития в цельной крови и в лобной доли головного мозга оставались весьма стабильными в течение, по крайней мере, 40—45 ч после прохождения пика концентрации. Данное наблюдение может указывать, во-первых, на преимущественное накопление лития в цельной крови и в лобных долях при использовании аскорбата лития и, во-вторых, на поддержание концентраций лития в этих органах за счёт некоторого «депо» лития.

ФК-кривые аскорбата лития для 6 из 11 исследованных биосубстратов имели только один пик (Tmax в районе 1—1,5 ч) с последующим медленным снижением концентрации лития (печень, головной мозг, лобная доля, цельная кровь, сердце, почки), происходящим, вероятно, вследствие выведения лития. Для 5 из 11 биосубстратов (надпочечники, селезёнка, аорта, бедренная кость, лёгкие) ФК-кривые характеризовались присутствием второго, пологого пика концентраций лития, наблюдаемого через 10—20 ч после начала эксперимента (в случае бедренной кости — через 20—30 ч, см. рис. 1). Можно предположить, что именно эти органы (надпочечники, селезёнка, аорта, бедренная кость) и также головной мозг и образуют своего рода «депо» лития, которое способствует поддержанию стабильных концентраций лития в цельной крови и в головном мозге. Существование такого «депо» лития подтверждается результатами проведённого нами многокамерного фармакокинетического анализа.

Многокамерный фармакокинетический анализ аскорбата лития

Для многокамерного ФК-анализа была использована ФК-кривая для содержания лития в цельной крови, указанная на рис. 3, т. к. анализ содержания препаратов в крови — основа фармакокинетического анализа. Данная кривая характеризуется выраженным пиком концентраций лития через 1—1,5 ч после зондирования и довольно пологим участком, указывающим на медленное выведение лития из крови.

Для получения наиболее адекватной многокамерной модели были исследованы одно, двух, трёх и четырёхкамерные модели в различных конфигурациях. В результате моделирования было установлено, что самой простой моделью, наиболее точно описывающей исследуемую ФК-кривую (рис. 3) является трёхкамерная модель, включающая ЖКТ (1-й компартмент), цельную кровь (центральный, 2-й компартмент) и депо лития (3-й компартмент), причём элиминация лития осуществляется из центрального компартмента, а не из депо (рис. 4).

Качество исследованных многокамерных моделей характеризовалось значениями стандартного отклонения концентраций между теоретической и экспериментально полученной ФК-кривыми, а также коэффициентом корреляции между теоретическими и экспериментальными значениями концентраций лития в цельной крови (рис. 5). Для полученной трёхкамерной модели, представленной на рис. 4, значение среднеквадратичного отклонения концентраций составило a = 3,4 мкг/л (при коэффициенте корреляции, равном 0,92), что указывает на приемлемое качество полученной модели.

Полученная модель является оптимальной по качеству и сложности. Более простые многокамерные ФК-модели характеризовались гораздо более низким качеством. Более сложные модели не приводили к существенному повышению качества модели.

Например, удаление компартмента «депо» из модели на рис. 4 приводило к существенному повышению среднеквадратичного отклонения концентраций (а = =10 мкг/л), также, как и удаление компартмента «ЖКТ» (а=15 мкг/л). Моделирование процесса элиминации только из депо также резко снижало качество модели (а =5,6 мкг/л), в то время как моделирование элиминации и из депо, и из центрального компартмента не улучшало качество модели (а = 3,5 мкг/л). Включение в модель процесса обмена между депо и ЖКТ также снижало качество модели (а = 4,5 мкг/л).

Таким образом, трёхкамерная модель фармакокинетики аскорбата лития, в которой раствор соли переходит из ЖКТ в центральный компартмент (цельную кровь), затем — в депо, а элиминация происходит только из центрального компартмента (рис. 4) является наиболее адекватной из исследованных многокамерных моделей. ФК- моделирование позволило получить количественные оценки соответствующих констант скорости и объёмов компартментов (табл. 1).

Таким образом, моделирование показало, что объём депо составляет примерно половину от объёма центрального компартмента (т. е. цельной крови, см. табл. 1). Аскорбат лития достаточно быстро переносится из ЖКТ в кровь (k12 = 0,67 1/ч) и весьма медленно удаляется из цельной крови (что соответствует малому значению константы ke_Central=0,0068 1/ч). Скорость обмена лития между кровью и депо сравнима со скоростью переноса из ЖКТ в кровь, причём перенос лития из цельной крови в депо (Kcd = 0,41 1/ч) осуществляется несколько быстрее, чем обратный процесс переноса лития из депо в цельную кровь (Kdc = 0,271/ч).

К сожалению, имеющиеся ФК-данные не позволяют сделать количественно достоверных выводов о том, какие же именно органы составляют «депо» лития. Однако сравнение динамики концентраций лития в депо, полученном в результате моделирования, с динамикой концентрации лития в «депо», состоящем из головного мозга, аорты, надпочечников и бедренной кости указывает на определенную схожесть изменения концентраций (рис. 6). Очевидно, что депо, состоящее из этих органов, по крайней мере, позволяет стабилизировать концентрации лития после первых 10—15 ч эксперимента.

Бескамерный фармакокинетический анализ аскорбата лития

Бескамерный анализ позволяет охарактеризовать такие повсеместно используемые ФК- параметры препарата как максимальная концентрация лития в биосубстрате — Cmax, время достижения максимальной концентрации — Tmax, последняя измеренная концентрация лития — Clast, площадь под кривой — AUCt, среднее время удержания — MRTt, наклон участка финального выведения — Lz, период полувыведения — T1/2, клиренс — CL, объём распределения — VD. Параметры бескамерной модели были рассчитаны для всех исследованных биосубстратов на основании соответствующих ФК-кривых (табл. 2).

Полученные в рамках бескамерного анализа значения ФК- параметров аскорбата лития подтверждают сделанные выше выводы. Во-первых, время достижения максимума (Tmax) составило 1—1,5 ч для большинства биосубстратов (за исключением селезёнки, надпочечников и бедренной кости, в которых Tmax = 12—24 ч).

Во-вторых, наиболее стабильно литий накапливается именно в лобной доле (Clast=40,5 мкг/л — самое высокое значение концентрации через 48 ч среди исследованных биосубстратов). Этот вывод подтверждает и значение площади под кривой: значение AUCt для лобной доли составило 2 094 мкг/л х ч, в то время как, например, для печени (в который были отмечены наиболее высокие пиковые концентрации лития) — 2 031 мкг/л х ч. Литий эффективно накапливался также в сердце (AUCt = 2 123 мкг/л х ч) и в надпочечниках (AUCt = 1 969 мкг/л х ч).

В-третьих, низкое значение наклона участка финального выведения (Lz) и высокое значение периода полувыведения (Т1/2) были характерны для всех биосубстратов, особенно для цельной крови (Lz = 0,005 1/ч, Т,/2 = 141 ч), головного мозга, в т. ч. лобной доли (Lz = 0,007 1/ч, Т1/2 = 210 ч), почек (Lz = 0,004 1/ч, Т1/2=179 ч) и бедренной кости (Lz=0,0021/ч, Т1/2=451 ч). Накопление лития в лобной доле и в кости подтверждается наиболее низкими значениями клиренса именно для этих биосубстратов (лобная доля — CL=0,017 л/ч; бедренная кость — CL = 0,011 л/ч). Таким образом, аскорбат лития способствует поддержанию стабильных концентраций иона лития в цельной крови и в головном мозге, что важно для осуществления профилактического и терапевтического потенциала лития.

Основные выводы

Многокамерный фармакокинетический анализ показал, что стабилизация уровней лития в крови и в головном мозге поддерживается за счёт специального «депо» лития, состоящего, вероятно, из надпочечников, селезёнка, аорты, лёгких и бедренной кости. Концентрации лития в цельной крови и в лобной доли головного мозга оставались весьма стабильными в течение, по крайней мере, 40-45 ч после прохождения пика концентрации. Полученные в рамках бескамерного анализа значения ФК- параметров аскорбата лития подтверждают сделанные выше выводы и показывают, что аскорбат лития способствует поддержанию стабильных концентраций иона лития в крови и в головном мозге, что важно для осуществления профилактического и терапевтического потенциала лития.