Введение

Одним из современных направлений в области поиска и создания эффективных и безопасных психотропных средств для лечения нарушений в психоэмоциональной сфере рассматривается их разработка на основе эндогенных соединений регуляторных пептидов. Так, например, нейропептид окситоцин устраняет тревожную симптоматику, депрессию и психозы при шизофрении [1] и купирует проявления алкогольной абстиненции у больных наркологического профиля [2]. Анксиолитическая активность синтетического аналога тафтсина селанка оказалась сопоставимой с положительным действием медазепама при фармакотерапии больных с генерализованными тревожными расстройствами [3]. Согласно экспериментальным данным, фрагмент кортикотропина АКТГ4-10 семакс вызывает коррекцию негативных последствий неонатального стресса [4], нейропептид Y проявляет противотревожные свойства на модели пост-травматического стрессового расстройства [5]. Приведённые выше данные о психотропной активности пептидов и их аналогов описаны для интраназального способа введения, к недостаткам которого относят выраженные индивидуальные физиологические отличия, следствием которых является разная биодоступность препаратов, возможные осложнения, связанные с местным введением, ограниченность данных по оценке безопасности системно действующих лекарственных средств. Наличие специфических переносчик-опосредованных транспортных систем для коротких пептидов определяет их уникальную способность к всасыванию в кишечнике, что открывает перспективы создания пептидных препаратов для перорального применения [6].

Опираясь на экспериментальные и клинические данные о вовлечённости эндогенной холецистокининовой (ХЦК) системы в формирование тревожных состояний, в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» в отделе химии (рук. член-корр. РАН Т.А. Гудашева) сконструирован, синтезирован и фармакологически изучен дипептидный аналог тетрапептида холецистокинина (ХЦК) амид N-(6фенилгексаноил)-глицил-L-триптофана (соединение ГБ-115) [7]. ГБ-115 при парентеральном и пероральном введении обладает выраженными анксиолитическими свойствами у инбредных животных с генетически детерминированной «пассивной» реакцией на эмоциональный стресс [8], а также купирует тревожный компонент синдрома «отмены» у крыс со сформированной зависимостью от бензодиазепиновых транквилизаторов [8], не вызывая при этом толерантности и формирования синдрома «отмены» per se [9].

В ранее проведённых исследованиях методами фармакокинетики показана возможность перорального применения фармакологически активных дипептидов [10]. В опытно-технологическом отделе ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» (рук. проф. Б.М. Пятин) с учётом физико-химических свойств субстанции ГБ-115 был разработан и фармакологически изучен ряд фармацевтических композиций для изготовления твёрдой лекарственной формы ГБ-115 [11].

Цель настоящей работы — сравнительная оценка анксиолитических свойств дипептидного аналога ХЦК-4 и феназепама у животных с повышенным уровнем эмоциональности при введении в таблетированной форме.

Материалы и методы

Животные. Эксперименты выполнены на инбредных мышах-самцах линий BALB/c массой 18—20 г и беспородных крысах-самцах массой 450—530 г (филиал «Андреевка» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России). Мышей содержали по 10 особей в клетке (370 х 200 х 150 мм) в стандартных условиях вивария ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» при регулируемом световом режиме (12 ч — свет/12 ч — темнота) и постоянной температуре (21—230 °С) со свободным доступом к воде и брикетированному корму в течение 10 сут до начала тестирования в соответствии с приказом МЗ РФ № 199н от 23.08.2010 «Об учреждении Правил лабораторной практики».

Препараты. Соединение ГБ-115 в таблетках 1,0 мг (ОТО ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»), феназепам в таблетках 1,0 мг (Валента Фармацевтика ОАО, Россия), спирт этиловый 96%, разбавленный водой дистиллированной до 10 об.% (ООО «Главспирт»).

Выбор эффективных доз ГБ-115 0,25—2,0 мг/кг основан на результатах ранее проведённых исследований [8]. Для человека суточная доза феназепама для лечения выраженной ажитации, страха и тревоги составляет 3,0 мг/сут, соответственно, расчёт дозы феназепама для животных (ЛСж) проводили на основе терапевтической дозы для человека по формуле:

доза ЛСж (мг/кг) = (Доза для человека (мг/кг) х коэффициент человека)/коэффициент животного,

где: коэффициент человека — 37, коэффициент мыши — 3, коэффициент крысы — 6 [12].

Все вещества вводили из расчёта 0,1 мл/10 г массы тела (мыши) и 0,1 мл/100 г массы тела (крысы) животных.

Методики. Оценку тревожности в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) проводили в соответствии с методикой, описанной ранее для мышей [13] и для крыс [14]. Животных помещали на центральную площадку и в течение последующих 300 с фиксировали основные параметры, а именно время нахождения в открытых рукавах (в с), число заходов в открытые рукава, число заходов в закрытые рукава. Показатели «время в открытых рукавах» и «число заходов в открытые рукава» сравнивали в процентах, которые рассчитывали по формуле: время в открытых рукавах (в %) = (время в открытых рукавах в с / 300 с) х 100%; число заходов в открытые рукава в % = (число заходов в открытые рукава / общее число заходов в открытые и закрытые рукава) х 100%.

Увеличение времени нахождения в открытых рукавах при отсутствии изменений двигательной активности (общее число заходов в открытые и закрытые рукава) рассматривали как проявление анксиолитического эффекта.

Спонтанную двигательную активность регистрировали в актометре Opto-Varimex-4 (США) в соответствии с ранее описанной методикой [15].

Для моделирования состояния алкогольной абстиненции беспородным крысам-самцам (n = 38), содержащимся в индивидуальных клетках (370 х 200 х 150 мм) в условиях вивария ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» со свободным доступом к брикетированному корму с предоставлением 10% раствора этанола в качестве единственного источника жидкости. К концу 33-й недели потребление этанола составляло в среднем 4,80 ± 0,11 г/кг. Анксиолитическое действие феназепама и ГБ-115 оценивали в ПКЛ через 48 ч после отмены этанола у животных со «средним» уровнем алкогольной мотивации, который определяли по показателю алкоголь-депривационного эффекта [15].

Статистическая обработка. Оценку достоверности полученных результатов проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим использованием LSD теста, а также непараметрического U критерия Манна-Уитни для независимых групп.

Межгрупповые сравнения с использованием LSD теста осуществляли при условии, что значимый эффект был выявлен процедурой дисперсионного анализа. Данные представлены в виде М±SEM. 

Результаты

Исходя из гипотезы, согласно которой для реализации противотревожного действия антагонистов ХЦК-рецепторов необходимо наличие нейрохимического «субстрата», определяющего изначально высокий уровень тревоги и страха [16, 17], изучали фармакологическую активность ГБ-115, одной из первичных мишеней действия которого являются центральные ХЦК-рецепторы [18], с использованием релевантных экспериментальных моделей. Опыты выполнены на инбредных мышах линии BALB/c, характеризующихся повышенным уровнем эмоциональности в условиях новизны и смены окружающей обстановки, и беспородных крысах со сформированной алкогольной зависимостью в условиях индуцированного отменой этанола анксиогенеза.

Сравнительная оценка влияния феназепама (таблетка 1,0 мг) и ГБ-115 (таблетка 1,0 мг) на поведение мышей BALB/c в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт»

В первой серии экспериментов был проведён подбор анксиолитической дозы феназепама для последующего сопоставления эффектов дипептидного аналога ХЦК-4 ГБ-115 с классическим бензодиазепиновым транквилизатором. Показано, что феназепам при введении per os в дозах 0,5 и 1,0 мг/кг за 60 мин до тестирования дозозависимо препятствует формированию симптомов тревожной реакции у мышей BALB/c, статистически значимо увеличивая время пребывания животных в открытых рукавах лабиринта (р < 0,01 и р < 0,001, соответственно), количество выходов в открытые рукава лабиринта (р < 0,05 и р < 0,01, соответственно), снижая в дозе 1,0 мг/кг двигательную активность, оцениваемую по количеству заходов в закрытые рукава ПКЛ (р < 0,05) (рис.1).

При изучении влияния ГБ-115 в диапазоне доз 0,25—2,0 мг/кг при введении рег os за 60 мин до тестирования на тревожное поведение мышей BALB/c в тесте ПКЛ установлена дозозависимая анксиолитическая активность с максимально выраженным эффектом в дозе 1,0 мг/кг (рис. 1). Установлено, что дипептидный анксиолитик статистически значимо увеличивал время пребывания в открытых рукавах (F(4, 49) = 18,944, р = 0,00000) и число выходов в открытые рукава (F(4, 49) = 15,975, р = 0,00000), не влияя на общую двигательную активность животных. При сопоставлении анксиолитических свойств дипептида ГБ-115 и феназепама очевидно, что ГБ-115 в эффективной дозе 1,0 мг/кг не уступает референтному препарату в дозе 0,5 мг/кг в тесте ПКЛ (рис. 1). Дипептид увеличивает время нахождения в открытых рукавах лабиринта в 6,2 раза, в то время как феназепам в дозе 0,5 мг/кг - в 2,8 раза. Далее, ГБ-115 значительно увеличивает число выходов в открытые рукава по сравнению с феназепамом (в 3,4 раза,р < 0,001 и в 1,6 раз, р < 0,05, соответственно) и не влияет на общую двигательную активность, что свидетельствует о выраженных анксиолитических свойствах дипептидного анксиолитика при отсутствии побочного седативного эффекта. По скорости наступления эффекта ГБ-115 при пероральном введении не уступает феназепаму и может быть использован для быстрого купирования приступов тревоги и страха. Поскольку в ранее проведённых исследованиях ГБ-115 при различных способах введения не оказывал влияния на двигательную активность животных, для сравнительной оценки его действия был выбран феназепам в дозе 0,5 мг/кг.

Сравнительная оценка влияния ГБ-115 и феназепама на тревожное поведение крыс при отмене этанола в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт»

Опыты выполнены на беспородных крысах-самцах со сформированной алкогольной мотивацией. При моделировании синдрома отмены этанола, прежде всего, необходимо было доказать, что при данном режиме потребления алкоголя у крыс развивается тревожная реакция в ответ на лишение доступа к алкоголю. На фоне 48-часовой алкогольной депривации у животных выявлен выраженный анксиогенез в тесте ПКЛ (табл. 1), который проявлялся в сокращении времени пребывания в открытых рукавах (р < 0,001) и числа выходов в открытые рукава лабиринта (р < 0,01) при снижении общей двигательной активности (р < 0,05) по сравнению с интактными крысами того же возраста, что позволяет сделать вывод об адекватности выбранной модели «алкоголизации».

Стандартный препарат для купирования симптомов алкогольной абстиненции феназепам (таблетки 1,0 мг) при пероральном введении за 45 мин до тестирования в дозе 0,25 мг/кг проявлял анксиолитическую активность у крыс через 48 ч после отмены этанола в тесте ПКЛ, увеличивая время пребывания и число заходов в открытых рукавах ПКЛ (р < 0,01 и р < 0,05, соответственно) (см. табл. 1). ГБ-115 в дозах 0,7 и 0,9 мг/кг при однократном введении за 45 мин до тестирования также существенно влиял на основные параметры тревожного поведения, статистически значимо увеличивая время пребывания в открытых рукавах ПКЛ в дозе 0,9 мг/кг (р < 0,05) по сравнению с группой «отмена этанола» и на 60% повышая данный показатель по сравнению с интактными животными, что указывает на выраженное противотревожное действие дипептидного аналога ХЦК-4.

Выраженность фармакологических эффектов ГБ-115 имела дозовую зависимость. В условиях данного эксперимента феназепам и ГБ-115 не влияли на общую двигательную активность животных, оцениваемую по общему числу заходов в рукава ПКЛ (см. табл. 1).

Сравнительная оценка влияния ГБ-115 и феназепама в анксиолитических дозах на спонтанную двигательную активность

С целью исключения возможных седативных или психостимулирующих свойств, изучено влияние ГБ- 115 (таблетки 1,0 мг) в диапазоне доз 0,5—2,0 мг/кг на спонтанную двигательную активность «высоко-тревожных» мышей BALB/c. ГБ-115 в изученных дозах при однократном введении за 60 мин до тестирования не оказывал влияния на спонтанную двигательную активность мышей BALB/c в течение 10 мин наблюдения (рис. 2).

Феназепам (таблетки 1,0 мг) в дозе 0,5 мг/кг через 60 мин после однократного введения значительно изменял поведенческий профиль мышей BALB/c, статистически значимо сокращая общее пройденное расстояние (р < 0,05) и увеличивая продолжительность пребывания животных без движения (р < 0,001) (рис. 2). Согласно данным, представленным в табл. 2, в отличие от ГБ-115 феназепам в эффективной анксиолитической дозе значительно снижал общую и исследовательскую активность, увеличивая при этом время нахождения мышей BALB/c без движения, что свидетельствует о выраженном седативном действии и соответствует клиническим наблюдениям [19].

Обсуждение

Показанная анксиолитическая активность пептида ГБ-115 при пероральном введении в твёрдой лекарственной форме согласуется с результатами ранее выполненных фармакокинетических исследований. Рассчитанные параметры полувыведения 63,86 мин, среднее время удержания пептида в неизменном состоянии 95,75 мин, достижение максимальной концентрации через 15 мин после введения фармацевтической композиции свидетельствуют об устойчивости дипептида к действию протеолитических ферментов по сравнению с природными нейропептидами [11]. Высокая биодоступность устойчивых к энзиматической деградации ди- и трипептидов определяется их взаимодействием с транспортёрами пептидов, которые представляют собой белки, обеспечивающие их перемещение через биологические мембраны посредством направленного внутрь протонного градиента и отрицательного мембранного потенциала. В опытах на изолированных фрагментах кишечника для дипептида глицилсаркозина (Gly-Sar) установлена предельная проницаемость и специфичность для протон-сопряжённого олигопептидного транспортёра РерТ1[20]. Наряду с этим, активно обсуждается в научной литературе подход для повышения биодоступности биологически активных соединений, в частности увеличения абсорбции в кишечнике, основанный на создании «про-лекарств» путём присоединения дипептидов в качестве субстратов для транспортёра hРерТ1, обеспечивающего перенос коротких пептидов и пептидомиметиков [21].

Полученные в настоящей работе результаты подтверждают современные исследования, обосновывающие целесообразность и перспективу использования коротких пептидов с целью купирования тревожных состояний.

Так, дипептид Tyr-Leu в диапазоне доз 0,3—3,0 мг/кг при введении per os проявлял анксиолитические свойства в ПКЛ в опытах на мышах посредством активации серотониновых 5-HT(1A), дофаминовых D(1) и ГАМК(А)-рецепторов [22]. Дипептид Met-His (wheylin-1), синтезированный низкомолекулярный фрагмент бета-лактоглобулина(145-146), демонстрировал противотревожную активность, обусловленную активацией ГАМК(А)-рецепторов, сопоставимую с диазепамом при пероральном введении, при этом замена аминокислотной последовательности на His- Met приводила к утрате биологической активности у ретро-пептида [23].

Помимо самостоятельного терапевтического потенциала короткие пептиды с анксиолитической активностью могут использоваться в качестве адьювантов при назначении классических транквилизаторов с целью снижения выраженности и/или минимизации таких побочных эффектов производных бензодиазепинов, как седация, нарушение памяти, расстройство сна и т. д.), на что указывает положительный опыт совместного применения селанка и феназепама в клинической практике [19].

На основании проведённых исследований при использовании животных с генетически детерминированной «пассивной» реакцией на эмоциональный стресс и в условиях индуцированного анксиогенеза установлено, что дипептидный аналог эндогенного холецистокинина-4 соединение ГБ-115 в таблетках по 1,0 мг обладает выраженным анксиолитическим действием, сопоставимым с феназепамом, при отсутствии седативной реакции, характерной для производных 1,4-бензодиазепинов.