Введение

Лаппаконитин — алкалоид, получаемый из растения аконит белоустный (лат. Aconitum leucostomum) [1]. Созданный на его основе лекарственный препарат лаппаконитина гидробромид (син. аллапинин), согласно классификации Vaughan Williams, относится к антиаритмическим лекарственным средствам ГС класса [2]. Антиаритмики IC класса — это т.н. мембраностабилизирующие препараты, являющиеся блокаторами трансмембранных потенциал-зависимых быстрых натриевых каналов [3]. Антиаритмическое действие этих препаратов основано на удлинении фаз быстрой деполяризации и медленной деполяризации [4, 5]. Эти фазы обеспечиваются работой натриевых каналов. Фаза быстрой деполяризации обеспечивает генерацию потенциала действия, когда в процесс вовлекается большое количество высокопороговых потенциал-зависимых натриевых каналов. Фаза медленной деполяризации — это фаза, предшествующая генерации потенциала действия. В это время открываются низкопороговые потенциал-зависимые натриевые каналы [6]. Функция этих каналов — поднять потенциал мембраны до порога, достаточного для генерации потенциала действия. Таким образом, удлинение фазы быстрой деполяризации увеличивает продолжительность переднего фронта потенциалов действия, а удлинение фазы медленной деполяризации увеличивает интервалы между ними и снижает частоту сердечных сокращений [7].  

Антиаритмики IC вызывают выраженное угнетение скорости деполяризации и амплитуды фазы 0 потенциала действия кардиомиоцитов и, как следствие этого, замедление процессов проведения и возбуждения в миокарде предсердий и желудочков.

В клинике лаппаконитина гидробромид применяют для лечения желудочковой и наджелудочковой экстрасистолии; пароксизмальной наджелудочковой тахикардии, в том числе и при синдроме Вольфа-Паркинсона-Уайта; пароксизмах трепетания и мерцания предсердий; пароксизмальной желудочковой тахикардии в случае отсутствия органических изменений миокарда [8, 9]. Однако он, так же, как и другие антиаритмики IC класса, обладает большим количеством побочных эффектов, в том числе и проаритмическим действием [10].

Цель настоящего исследования — изучение особенностей электрофизиологических механизмов действия нового оригинального отечественного комбинированного антиаритмического лекарственного средства ЛМГ-124, содержащего в своём составе лаппаконитина гидробромид, однако отличающегося от него тем, что оно реализует свои антиаритмические эффекты в более низких дозах и тем самым потенциально менее токсично.

Методы

Первичная культура клеток гиппокампа

В работе использовали смешанную нейроглиальную культуру клеток гиппокампа, выделенную из мозга новорождённых (Р1-3) крыс линии Вистар. После декапитации извлекали мозг и переносили его в чашку Петри с холодным раствором Версена на льду. Мозг разрезали вдоль, удаляли сосудистые оболочки, средний и задний мозг. Извлекали гиппокамп и переносили в холодный раствор Версена. Далее ткань аккуратно измельчали ножницами и помещали в раствор Версена с добавлением 0,1% трипсина и инкубировали 10 мин при 37 °С на термошейкере при 600 об/мин. Затем кусочки ткани трижды отмывали нейробазальной средой (Neurobasal A) и диссоциировали путём энергичного пропускания через наконечник пипетки. Полученную суспензию центрифугировали 3 мин при 300 g. Супернатант удаляли, клетки ресуспендировали в нейробазальной среде с добавлением глутамина (0,5 мМ), Supplement B27 (2%), гентамицина (15 мкг/мл). Готовую суспензию помещали в стеклянные цилиндры со шлифованными торцами с внутренним диаметром 6 мм, поставленные на круглые покровные стекла диаметром 25 мм (VWR International), покрытые полиэтиленимином из расчёта 1 гиппокамп на 10 стекол и помещали в 35 мм чашки Петри (Greiner). В каждый цилиндр помещали 100 мкл суспензии клеток и оставляли на 1 ч для прикрепления в СО2-инкубаторе при 37 °С. После этого цилиндры извлекали, а объём культуральной среды доводили до 1,5 мл. Дважды в неделю культуральную среду (2/3 объёма) меняли на свежую. В экспериментах использовали клетки как возрастом 1-3 дня (до образования нейронных сетей), так и возрастом 9-14 дней культивирования (после образования нейронных сетей).

Patch-clamp регистрация в конфигурации «whole cell»

Электрическую активность нейронов регистрировали методом patch-clamp в конфигурации whole cell, с помощью усилителя Axopatch 200 B (Axon Instruments), ЦАП-АЦП конвертера DigiData 1440A и пакета лицензионных программ pClamp 10,2 (Axon Instruments). Все эксперименты выполнялись при 24-27 °С. В качестве внеклеточного раствора использовали среду Хенкса (мМ): NaCl - 139, NaHCO3 - 4,17, Na^PO4 - 0,4, KCl - 2,1, KH2PO4, CaCl2 - 1,25, MgSO4 - 1,25, HEPES - 8, D-глюкоза - 8, pH - 7,4 (для доведения pH использовался раствор NaOH). Внутриклеточный раствор для заполнения микроэлектродов имел следующий состав в мМ: метансульфонат калия - 145, KCl - 20, Hepes - 10, EGTA - 0,5, MgCl2 - 1, pH = 7,2 (для доведения pH использовался раствор KOH). Сопротивление кончика пипетки 4,5-6 МОм. Рассматривались лишь клетки со значением сопротивления доступа не более 25 МОм.

Для исследования натриевых токов использовалась культура нейронов гиппокампа возрастом 1-3 дня. Для записи натриевых токов использовался внутриклеточный раствор, в котором все соли калия были заменены на соли цезия с целью ингибирования калиевых токов (для доведения pH использовался раствор CsOH). Записи производились в режиме фиксации потенциала. После добавки вещества на клетку подавались ступеньки напряжения — 30 mV (ток достигал максимальных значений у большинства клеток при этом стимуле) продолжительностью 50 мс, с интервалом 5 с на протяжении 5 мин. Для стандартизации значений токов, результаты записи с каждой клетки делились на ёмкость данной клетки.

Для исследования влияния препарата ЛМГ-124 и прототипа лаппаконитина гидробромида на вызванные потенциалы действия и интервалы между ними были использованы культуры возрастом 9-10 дней. Записи производились в режиме фиксации тока. На клетки подавались токовые стимулы различных значений (от 10 до 200 pA с шагом 5 pA), продолжительность стимуляции составляла 500 мс, интервалы между стимулами 5 с. Регистрацию напряжения производили до и после 5-минутной стимуляции, аналогично опытам по регистрации тока. Эксперименты с каждой концентрацией веществ были повторены не менее чем на 3 культурах. Растворы исследуемых веществ каждый раз готовились непосредственно перед экспериментом.

Соединение ЛМГ-124 и прототип лаппаконитина гидробромид были представлены для исследований Федеральным государственным бюджетным учреждением науки Уфимский институт химии Российской академии наук (УфИХ РАН). 

Результаты

Изучение влияния соединения ЛМГ-124 на трансмембранный Na+ ток

В предварительных экспериментах было показано, что как лаппаконитина гидробромид, так и ЛМГ-124, обладают способностью постепенно ингибировать Na+ каналы. Натриевый канал плазматической мембраны возбудимых клеток может находиться в открытом, закрытом и инактивированном состояниях. При достижении порога активации он открывается и инактивируется через 1—2 мс. В этом состоянии он пребывает всё оставшееся время, пока мембрана остаётся деполяризованной. Согласно литературным данным, лаппаконитина гидробромид связывается с Na+ каналом тогда, когда тот находится в открытом состоянии [12]. Поэтому при регистрации суммарного эффекта ингибирование натриевого тока развивается во времени. Соответственно, чем чаще происходит стимуляция клетки, тем больше каналов будет заблокировано. В связи с этим, для получения концентрационных зависимостей действия лаппаконитина гидробромида и ЛМГ-124 на натриевый ток, клетки предварительно инкубировали с исследуемыми соединениями от 0 до 20 мин. Для увеличения времени нахождения Na+ каналов в открытом состоянии клетки подвергались стимуляции с различной частотой на протяжении 5 мин. Концентрации изучаемых соединений изменяли от 50 до 500 мкМ.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что соединение ЛМГ-124 эффективно блокирует быстрый входящий Na+ ток в концентрациях вдвое меньше, чем прототип — лаппаконитина гидробромид: соответственно 125—150 мкМ и 250—500 мкМ. На рис. 1 показаны изменения Na+ тока после 5 мин стимуляции (деполяризация — 30 мУ) с частотой 0,2 Гц в контроле и в присутствии 250 и 500 мкМ лаппаконитина гидробромида или 125 и 150 мкМ ЛМГ-124.

Как видно из рис. 1, оба соединения ингибируют амплитуду быстрого Na+ тока. Полное ингибирование Na+ тока в этих условиях наблюдалось при 500 µМ лаппаконитина гидробромида и при 150 µМ ЛМГ-124.

Кинетику увеличения степени ингибирования регистрировали в течение 20 мин в присутствии различных концентраций соединений. На рис. 2А показано изменение амплитуды Na+ тока во времени, в течение 20 мин, при измерении каждые 5 мин в присутствии различных концентраций соединений. Показано, что ингибирование увеличивается в течение 20 мин после аппликации исследуемых соединений. Исходная амплитуда Na+ тока в каждом эксперименте была принята за 1. Полное ингибирование натриевого тока за 20 мин достигалось для лаппаконитина гидробромида при концентрации 500 µМ, а для ЛМГ-124 — при 150 µМ.

На рис. 2 демонстрируется постепенное нарастание степени ингибирования Na+ тока в течение 20 мин при стимуляции 1 раз в 5 мин в присутствии различных концентраций лаппаконитина гидробромида (рис. 2А) или ЛМГ-124 (рис. 2В). Нарастание ингибирования во времени объясняется тем, что лаппаконитина ги-дробромид и его производное (ЛМГ-124) связывается с Na+ каналом, когда тот находится в открытом состоянии, т. е. ингибирование происходит, главным образом, в момент стимуляции клетки.

Для изменения времени нахождения канала в открытом состоянии в следующем эксперименте оценивали степень ингибирования канала при увеличенной частоте стимуляции. На рис. 3 демонстрируется постепенное нарастание степени ингибирования Na+ тока в течение 5 мин при стимуляции с частотой 0,2 Гц в присутствии различных концентраций лаппаконитина гидробромида (рис. 3А) или ЛМГ-124 (рис. 3В).

И что важно, как следует из рис. 4, ЛМГ-124 гораздо эффективней подавляет Na+ ток, чем лаппаконитина гидробромид.

На рис. 4А, 4В суммированы данные зависимости эффекта ингибирования от концентрации для лаппаконитина гидробромида и ЛМГ-124 при низкой частоте стимуляции (4А). На рис. 4В эти же данные сравниваются с данными титровки при высокой частоте стимуляции. Как следует из полученных данных (рис. 4), максимальное ингибирование Na+ канала достигается тем быстрее, чем чаще производится стимуляция.

Действие ЛМГ-124 на вызванные потенциалы действия

Для исследования влияния ЛМГ-124 на частоту и различные фазы потенциалов действия были использованы культуры нейронов гиппокампа возрастом 9—10 дней, в режиме фиксации тока. Производилась контрольная запись вызванных потенциалов действия, после чего на «запэтченный» нейрон проводилась аппликация препарата, затем клетка подвергалась стимуляции на протяжении 5 мин (как в предыдущих экспериментах), далее запись вызванных потенциалов действия повторялась.

Как лаппаконитина гидробромид, так и ЛМГ -124 вызывают увеличение времени до генерации первого потенциала действия по сравнению с контролем. Это связано с замедлением медленной фазы деполяризации из-за блокировки Na+ каналов. Как видно из рис. 6, ЛМГ-124 увеличивает время до генерации первого потенциала действия значительно сильнее. Таким образом, для деполяризации клетки до порогового уровня в присутствии соединений требуется больший токовый стимул, нежели в контроле (рис. 5, 6).

Это связано с тем, что в присутствии исследуемых соединений уменьшается число функционирующих Na+ каналов и снижается проводимость мембраны клетки. На рис. 7 приведены зависимости значений тока, необходимых для генерации клеткой первого потенциала действия, от концентрации лаппаконитина гидробромида и ЛМГ-124. Показано, что эффект наблюдается для всех концентраций соединений.

Уменьшение частоты потенциалов действия под действием соединений ЛМГ-124, так же как и лаппаконитина гидробромид, вызывает уменьшение частоты потенциалов действия в пачке. Как видно из рис. 5 и 8, уменьшение частоты связано, в основном, с увеличением продолжительности фазы медленной деполяризации.

Необходимо отметить, что, в отличие от лаппаконитина гидробромида, ЛМГ-124 вызывает более выраженное увеличение продолжительности потенциала действия, связанное с замедлением фазы реполяризации, за которую отвечают и К+ каналы (рис. 9).

Для доказательства этого предположения мы измерили калиевый ток в контроле и в присутствии соединений. На рис. 10 показано изменение К+ токов в присутствии 100 µМ лаппаконитина гидробромида и 25 µМ ЛМГ-124 через 5 мин стимуляции. ЛМГ-124 вызывает заметное снижение амплитуды К+ тока, в то время как лаппаконитина гидробромид практически не влияет на К+ ток.

Выводы

1.Соединение ЛМГ-124 эффективно ингибирует быстрый входящий Na+ ток, протекающий через трансмембранные потенциал-зависимые быстрые Na+ каналы.

2.Обнаруженный эффект постепенного ингибирования Na+ канала характерен для обоих соединений (лаппаконитина гидробромида и соединения ЛМГ-124) и указывает на то, что их ингибирующий эффект реализуется на уровне открытого Na+ канала.

3.Выявленные концентрационные зависимости действия (доза—эффект) лаппаконитина гидробромида и соединения ЛМГ-124 на натриевый ток свидетельствуют о том, что эффективная доза соединения ЛМГ-124 во всех случаях в 2М-4 раза ниже, чем у лаппаконитина гидробромида.

4.Соединение ЛМГ-124 более эффективно, чем лаппаконитина гидробромид, ингибирует медленную фазу деполяризации клеток, что приводит к уменьшению частоты потенциалов действия в пачке;

5.В отличие от лаппаконитина гидробромида, соединение ЛМГ-124 блокирует не только Na+ каналы, но, частично и К+ каналы, в силу чего его можно отнести к антиаритмическим лекарственным средствам, потенциально обладающим свойствами антиаритмиков Ia класса по классификации Vaughan Williams.