phkineticaФармакокинетика и ФармакодинамикаPharmacokinetics and Pharmacodynamics2587-78362686-8830ООО «Издательство ОКИ»10.37489/2587-7836-2023-4-41-47phkinetica-391Research ArticleДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ФАРМАКОКИНЕТИКИPRECLINICAL PHARMACOKINETIC STUDIESФармакокинетика димерного дипептидного миметика фактора роста нервов ГК-2 у крыс. Часть 2. Кинетика распределения в органах и тканяхPharmacokinetics of dimeric dipeptide mimetic of nerve growth factor GK-2 in rats. Part 2. Kinetics of distribution in organs and tissueshttps://orcid.org/0000-0002-2571-0047КолывановГ. Б.KolyvanovG. B.

Колыванов Геннадий Борисович - д. б. н., в. н. с. лаборатории фармакокинетики 

Москва 

Gennadiy B. Kolyvanov - Dr. Sci. in Biology, leading researcher of the laboratory of pharmacokinetics 

Moscow 

https://orcid.org/0000-0002-2818-3457ЛитвинА. А.LitvinA. A.

Литвин Александр Алексеевич - д. б. н., в. н. с. лаборатории фармакокинетики 

Москва 

Alexander A. Litvin - Dr. Sci. in Biology, Leading researcher of thelaboratory of pharmacokinetics  

Moscow 

litbiopharm@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0001-8555-5969БочковП. О.BochkovP. O.

Бочков Павел Олегович - к. б. н., с. н. с. лаборатории фармакокинетики 

Москва 

Pavel O. Bochkov - PhD, Cand. Sci. (Biology), Senior Research Officer of laboratory pharmacokinetics 

Moscow 

https://orcid.org/0000-0002-0693-2007КравцоваО. Ю.KravtsovaO. Yu.

Кравцова Оксана Юрьевна - к. б. н., с. н. с. лаборатории фармакокинетики 

Москва 

Oxana Yu. Kravtsova - PhD, Cand. Sci. (Biology), senior research scientist of the laboratory of pharmacokinetics  

Moscow 

https://orcid.org/0000-0002-0693-2007ГрибакинаО. Г.GribakinaO. G.

Грибакина Оксана Геннадьевна - к. б. н., с. н. с. лаборатории фармакокинетики 

Москва 

Oxana G. Gribakina - PhD, Cand. Sci. (Biology), research scientist of the laboratory of pharmacokinetics 

Moscow 

https://orcid.org/0000-0003-3278-8915ПоварнинаП. Ю.PovarninaP. Yu.

Поварнина Полина Юрьевна - к. б. н., с. н. с. лаборатории пептидных биорегуляторов отдела химии лекарственных средств  

Москва 

Polina Yu. Povarnina - PhD, Cand. Sci. (Biology), senior researcher of the Laboratory of peptide bioregulators of the Department of Drug Chemistry 

Moscow 

https://orcid.org/0000-0003-2710-7134ЖердевВ. П.ZherdevV. P.

Жердев Владимир Павлович - д. м. н., профессор, заведующий лабораторией фармакокинетики 

Москва 

Vladimir P. Zherdev - Dr. Sci. (Med.), professor, Head of laboratory pharmacokinetics  

Moscow 

ФГБНУ «ФИЦ оригинальных и перспективных биомедицинских и фармацевтических технологий»РоссияFederal Research Center for Innovator and Emerging Biomedical and Pharmaceutical TechnologiesRussian Federation202322012024044147Copyright © Колыванов Г.Б., Литвин А.А., Бочков П.О., Кравцова О.Ю., Грибакина О.Г., Поварнина П.Ю., Жердев В.П., 20242024Колыванов Г.Б., Литвин А.А., Бочков П.О., Кравцова О.Ю., Грибакина О.Г., Поварнина П.Ю., Жердев В.П.Kolyvanov G.B., Litvin A.A., Bochkov P.O., Kravtsova O.Y., Gribakina O.G., Povarnina P.Y., Zherdev V.P.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.pharmacokinetica.ru/jour/article/view/391

Актуальность. Для внедрения соединения ГК-2 в клиническую практику необходимо провести доклиническое изучение его фармакокинетики, в частности, распределение исследуемого лекарственное средство (ЛС) в органах и тканях. Цель — изучение тканевой доступности нового оригинального соединения ГК-2 у крыс после его внутрибрюшинного введения. Методы. Количественное определение ГК-2 в плазме крови и гомогенатах органов/тканей крыс проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Результаты. На крысах изучено распределение ГК-2 в органах и тканях, имеющих различную степень васкуляризации. Установлено, что после однократного внутрибрюшинного введения ГК-2 в дозе 150 мг/кг исследуемое соединение регистрировалось в плазме крови на протяжении 2 ч, период полувыведения (t1/2el) его составил 0,4 ч. В органах и тканях ГК-2 детектировался от 1,5 до 2 ч. Тканевая доступность ГК-2 в системе «печень — плазма крови» составила 18,68; «почки — плазма крови» — 1,26; «селезёнка — плазма крови» — 0,68; «скелетные мышцы — плазма крови» — 0,31. Для органа-мишени — головного мозга — тканевая доступность составила 0,24. В головном мозге время достижения максимальной концентрации ГК-2 (0,77 мкг/г) составляло 0,34 ч. Установлено, что ГК-2 медленнее выводится из головного мозга (t1/2el составил 0,75 ч), чем из других органов и тканей (от 0,31 ч для селезёнки и до 0,47 ч для почек).

Relevance. To introduce the GK-2 compound into clinical practice, it is necessary to conduct a preclinical study of its pharmacokinetics, in particular, the distribution of the studied drug in organs and tissues. The aim is to study the tissue availability of a new original compound GK-2 in rats after its intraperitoneal administration. Methods. Quantitative determination of GK-2 in blood plasma and organ/tissue homogenates of rats was carried out by high-performance liquid chromatography with mass spectrometric detection. Results. The distribution of GK-2 in organs and tissues with varying degrees of vascularization was studied in rats. It was found that after a single intraperitoneal injection of GK-2 at a dose of 150 mg/kg, the studied compound was recorded in blood plasma for 2 hours, its half-life (t1/2el) was 0.4 hours. In organs and tissues, GK-2 was detected from 1.5 to 2 hours. The tissue availability of GK-2 in the liver — blood plasma system was 18.68; "kidneys — blood plasma" — 1.26; "spleen — blood plasma" — 0.68; "skeletal muscles — blood plasma" — 0.31. For the target organ, the brain, the tissue availability was 0.24. In the brain, the time to reach the maximum concentration of GK-2 (0.77 mcg/g) was 0.34 hours. It was found that GK-2 is excreted more slowly from the brain (t1/2el was 0.75 h) than from other organs and tissues (from 0.31 h for the spleen and up to 0.47 h for the kidneys).

фактор роста нервовдимерный дипептидный миметик ГК-2доклиническая фармакокинетикавысокоэффективная жидкостная хроматография-масс-спектрометрияnerve growth factordimeric dipeptide mimetic GK-2preclinical pharmacokineticshigh-performance liquid chromatography-mass spectrometryReferencesПирадов М.А. Инсульт : пошаговая инструкция / Пирадов М.А., Максимова М.Ю., Танашян М.М. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2019. 272 с. Piradov MA. Insult : Poshagovaya instrukcya. Piradov MA, Maximova MYu, Tanashyan MM. Moscow: GEOTAR-Media. 2019. (In Russ.).Пирадов М.А. Инсульт : пошаговая инструкция / Пирадов М.А., Максимова М.Ю., Танашян М.М. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2019. 272 с. Piradov MA. Insult : Poshagovaya instrukcya. Piradov MA, Maximova MYu, Tanashyan MM. Moscow: GEOTAR-Media. 2019. (In Russ.).Sims SK, Wilken-Resman B, Smith CJ, et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor and Nerve Growth Factor Therapeutics for Brain Injury: The Current Translational Challenges in Preclinical and Clinical Research. Neural Plast. 2022 Mar 2;2022:3889300. DOI: 10.1155/2022/3889300.Sims SK, Wilken-Resman B, Smith CJ, et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor and Nerve Growth Factor Therapeutics for Brain Injury: The Current Translational Challenges in Preclinical and Clinical Research. Neural Plast. 2022 Mar 2;2022:3889300. DOI: 10.1155/2022/3889300.Skaper SD. Peptide mimetics of neurotrophins and their receptors. Curr Pharm Des. 2011;17(25):2704–2718. DOI: 10.2174/138161211797415995.Skaper SD. Peptide mimetics of neurotrophins and their receptors. Curr Pharm Des. 2011;17(25):2704–2718. DOI: 10.2174/138161211797415995.Середенин С.Б., Гудашева Т.А. Патент РФ. 2011. № 2410392. Дипептидные миметики нейротрофинов ngf и bdnf. Доступно по: http://allpatents.ru/patent/2410392.html Ссылка активна на 15.09.2023 Seredenin SB, Gudasheva TA. Patent RF. 2011. № 2410392. Dipeptidnye mimetiki nejrotrofinov ngf i bdnf. (In Russ.). Доступно по: http://allpatents.ru/patent/2410392.html Ссылка активна на 15.09.2023.Середенин С.Б., Гудашева Т.А. Патент РФ. 2011. № 2410392. Дипептидные миметики нейротрофинов ngf и bdnf. Доступно по: http://allpatents.ru/patent/2410392.html Ссылка активна на 15.09.2023 Seredenin SB, Gudasheva TA. Patent RF. 2011. № 2410392. Dipeptidnye mimetiki nejrotrofinov ngf i bdnf. (In Russ.). Доступно по: http://allpatents.ru/patent/2410392.html Ссылка активна на 15.09.2023.Gudasheva TA, Povarnina PY, Tarasiuk AV, Seredenin SB. Lowmolecular mimetics of nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor: Design and pharmacological properties. Med Res Rev. 2021 Sep;41(5):2746–2774. DOI: 10.1002/med.21721.Gudasheva TA, Povarnina PY, Tarasiuk AV, Seredenin SB. Lowmolecular mimetics of nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor: Design and pharmacological properties. Med Res Rev. 2021 Sep;41(5):2746–2774. DOI: 10.1002/med.21721.Gudasheva TA, Logvinov IO, Nikolaev SV, et al. Dipeptide mimetics of different NGF and BDNF loops activate PLC-γ1. Dokl Biochem Biophys. 2020 Sep;494(1):244–247. DOI: 10.1134/S1607672920050075.Gudasheva TA, Logvinov IO, Nikolaev SV, et al. Dipeptide mimetics of different NGF and BDNF loops activate PLC-γ1. Dokl Biochem Biophys. 2020 Sep;494(1):244–247. DOI: 10.1134/S1607672920050075.Антипова Т.А., Гудашева Т.А., Середенин С.Б. Исследование in vitro нейропротективных свойств нового оригинального миметика фактора роcта нервов ГК-2. Бюлл. эксп. биол. мед. 2010;150(11):537–540. Antipova TA, Gudasheva TA, Seredenin SB. In vitro study of neuroprotective properties of GK-2, a new original nerve growth factor mimetic. Bull Exp Biol Med. 2011;150(5):607–609. (In Russ.).Антипова Т.А., Гудашева Т.А., Середенин С.Б. Исследование in vitro нейропротективных свойств нового оригинального миметика фактора роcта нервов ГК-2. Бюлл. эксп. биол. мед. 2010;150(11):537–540. Antipova TA, Gudasheva TA, Seredenin SB. In vitro study of neuroprotective properties of GK-2, a new original nerve growth factor mimetic. Bull Exp Biol Med. 2011;150(5):607–609. (In Russ.).Середенин С.Б. Романова Г.А., Гудашева Т.А. и др. Нейропротективное и антиамнестическое действие дипептидного миметика фактора роста нервов ГК-2 при экспериментальном ишемическом инфаркте коры головного мозга. Бюлл. эксп. биол. мед. 2010;150(10):406– 409. DOI: 10.1007/s10517-011-1161-y. Seredenin SB, Romanova GA, Gudasheva TA, et al. Neuroprotective and antiamnestic effect of nerve growth factor dipeptide mimetic GK-2 in experimental ischemic infarction of brain cortex. Bull Exp Biol Med. 2011 Feb;150(4):432–435. (In Russ.). DOI: 10.1007/s10517-011-1161-y.Середенин С.Б. Романова Г.А., Гудашева Т.А. и др. Нейропротективное и антиамнестическое действие дипептидного миметика фактора роста нервов ГК-2 при экспериментальном ишемическом инфаркте коры головного мозга. Бюлл. эксп. биол. мед. 2010;150(10):406– 409. DOI: 10.1007/s10517-011-1161-y. Seredenin SB, Romanova GA, Gudasheva TA, et al. Neuroprotective and antiamnestic effect of nerve growth factor dipeptide mimetic GK-2 in experimental ischemic infarction of brain cortex. Bull Exp Biol Med. 2011 Feb;150(4):432–435. (In Russ.). DOI: 10.1007/s10517-011-1161-y.Поварнина П.Ю. Гудашева Т.А., Воронцова О.Н., и др. Нейропротекторные эффекты димерного дипептидного миметика фактора роста нервов ГК-2 на модели двусторонней необратимой перевязки сонных артерий у крыс. Экспер. и клин. фармакол. 2012;75(9):15–20. DOI: 10.30906/0869-2092-2012-75-9-15-20. Povarnina PYu, Gudasheva TA, Vorontsova ON, et al. Neuroprotective effects of a dipeptide mimetic on the GK-2 nerve growth factor in model of permanent common carotid artery occlusion in rats. Exper Clin Pharmacol. 2012;75(9):15–20. (In Russ.). doi: 10.30906/0869-2092-2012-75-9-15-20.Поварнина П.Ю. Гудашева Т.А., Воронцова О.Н., и др. Нейропротекторные эффекты димерного дипептидного миметика фактора роста нервов ГК-2 на модели двусторонней необратимой перевязки сонных артерий у крыс. Экспер. и клин. фармакол. 2012;75(9):15–20. DOI: 10.30906/0869-2092-2012-75-9-15-20. Povarnina PYu, Gudasheva TA, Vorontsova ON, et al. Neuroprotective effects of a dipeptide mimetic on the GK-2 nerve growth factor in model of permanent common carotid artery occlusion in rats. Exper Clin Pharmacol. 2012;75(9):15–20. (In Russ.). doi: 10.30906/0869-2092-2012-75-9-15-20.Заржецкий Ю.В., Аврущенко М.Ш., Мороз В.В., и др. Эффективность миметика фактора роста нервов ГК-2 для предупреждения постреанимационных изменений мозга. Бюлл. эксп. биол. мед. 2015;159(4):442–445. DOI: 10.1007/s10517-015-2989-3. Zarzhetskiy YuV, Avruschenko MSh. Moroz VV, et al. Effectiveness of GK-2, a Nerve Growth Factor Mimetic, in Preventing Post-Resuscitation Changes in the Brain. Bull Exp Biol Med. 2015 Aug;159(4):453–455. (In Russ.). DOI: 10.1007/s10517-015-2989-3.Заржецкий Ю.В., Аврущенко М.Ш., Мороз В.В., и др. Эффективность миметика фактора роста нервов ГК-2 для предупреждения постреанимационных изменений мозга. Бюлл. эксп. биол. мед. 2015;159(4):442–445. DOI: 10.1007/s10517-015-2989-3. Zarzhetskiy YuV, Avruschenko MSh. Moroz VV, et al. Effectiveness of GK-2, a Nerve Growth Factor Mimetic, in Preventing Post-Resuscitation Changes in the Brain. Bull Exp Biol Med. 2015 Aug;159(4):453–455. (In Russ.). DOI: 10.1007/s10517-015-2989-3.Середенин С.Б., Поварнина П.Ю., Гудашева Т.А. Экспериментальная оценка терапевтического окна нейропротективной активности препарата ГК-2, низкомолекулярного миметика фактора роста нервов. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2018;118(7):49–53. DOI: 10.17116/jnevro20181187149. Seredenin SB, Povarnina PYu, Gudasheva TA. An experimental evaluation of the therapeutic window of the neuroprotective activity of a low-molecular nerve growth factor mimetic GK-2. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 2018;118(7):49–53. (In Russ.). DOI: 10.17116/jnevro20181187149.Середенин С.Б., Поварнина П.Ю., Гудашева Т.А. Экспериментальная оценка терапевтического окна нейропротективной активности препарата ГК-2, низкомолекулярного миметика фактора роста нервов. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2018;118(7):49–53. DOI: 10.17116/jnevro20181187149. Seredenin SB, Povarnina PYu, Gudasheva TA. An experimental evaluation of the therapeutic window of the neuroprotective activity of a low-molecular nerve growth factor mimetic GK-2. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 2018;118(7):49–53. (In Russ.). DOI: 10.17116/jnevro20181187149.Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. Методические рекомендации по проведению доклинических исследований фармакокинетики новых лекарственных средств / Миронов А. Н. (ред.). М.: Гриф и К, 2012. С. 865–880. Guidelines for conducting preclinical studies of drugs. Part one. Metodicheskie rekomendacii po provedeniyu doklinicheskih issledovanij farmakokinetiki novyh lekarstvennyh sredstv. Mironov AN (ed.). Moscow: Grif and K, 2012. P. 865–880. (In Russ.).Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. Методические рекомендации по проведению доклинических исследований фармакокинетики новых лекарственных средств / Миронов А. Н. (ред.). М.: Гриф и К, 2012. С. 865–880. Guidelines for conducting preclinical studies of drugs. Part one. Metodicheskie rekomendacii po provedeniyu doklinicheskih issledovanij farmakokinetiki novyh lekarstvennyh sredstv. Mironov AN (ed.). Moscow: Grif and K, 2012. P. 865–880. (In Russ.).Антипова Т.А., Гудашева Т.А., Середенин С.Б. Новые низкомолекулярные миметики фактора роста нервов. Докл. акад. Наук. 2010;4(1)6549–6552. DOI: 10.1134/S160767291005011X. Antipova TA, Gudasheva TA, Seredenin SB. Novel low-molecular-weight mimetics of the nerve growth factor. Dokl Biochem Biophys. 2010 SepOct:434:262–265. (In Russ.). DOI: 10.1134/S160767291005011X.Антипова Т.А., Гудашева Т.А., Середенин С.Б. Новые низкомолекулярные миметики фактора роста нервов. Докл. акад. Наук. 2010;4(1)6549–6552. DOI: 10.1134/S160767291005011X. Antipova TA, Gudasheva TA, Seredenin SB. Novel low-molecular-weight mimetics of the nerve growth factor. Dokl Biochem Biophys. 2010 SepOct:434:262–265. (In Russ.). DOI: 10.1134/S160767291005011X.Литвин А.А., Колыванов Г.Б., Блынская Е.В. и др. Количественное определение гексаметилендиаминдиамид бис-(N-моносукцинилL-глутамил-L-лизина) в плазме крови с использованием ВЭЖХ-МС. Вестн. Моск. Ун-та. Серия 2. Химия. 2019;60(3):194–197. Litvin AA, Kolyvanov GB, Blynskaya EV, et al. Quantification of hexamethylenediaminediamide bis-(N-monosuccinyl-L-glutamyl-L-lysine) in the blood plasma by HPLC-MS. Vestnik Moscovsckogo Universiteta. Seria 2. Khimia. 2019;60(3):194–197. (In Russ.).Литвин А.А., Колыванов Г.Б., Блынская Е.В. и др. Количественное определение гексаметилендиаминдиамид бис-(N-моносукцинилL-глутамил-L-лизина) в плазме крови с использованием ВЭЖХ-МС. Вестн. Моск. Ун-та. Серия 2. Химия. 2019;60(3):194–197. Litvin AA, Kolyvanov GB, Blynskaya EV, et al. Quantification of hexamethylenediaminediamide bis-(N-monosuccinyl-L-glutamyl-L-lysine) in the blood plasma by HPLC-MS. Vestnik Moscovsckogo Universiteta. Seria 2. Khimia. 2019;60(3):194–197. (In Russ.).Агафонов А.А., Пиотровский В.К. Программа М-ind системы параметров фармакокинетики модельно-независимым методом статистических моментов. Хим.-фарм. журн. 1991;10:16–19. Agafonov AA, Piotrovskiy VK. The M-ind program of the system of pharmacokinetics parameters by the model-independent method of statistical moments. Chem.-pharm. Journal. 1991;10:16–19. (In Russ.).Агафонов А.А., Пиотровский В.К. Программа М-ind системы параметров фармакокинетики модельно-независимым методом статистических моментов. Хим.-фарм. журн. 1991;10:16–19. Agafonov AA, Piotrovskiy VK. The M-ind program of the system of pharmacokinetics parameters by the model-independent method of statistical moments. Chem.-pharm. Journal. 1991;10:16–19. (In Russ.).Сергиенко В. И., Джеллифф Р., Бондарева И. Б. Прикладная фармакокинетика: основные положения и клиническое применение М.: Издательство РАМН, 2003. 302 с. Sergienko VI, Gelliff R, Bondareva IB. Prikladnaya Pharmacokinetika. Moscow: Izdatelstvo RAMN, 2003. (In Russ.).Сергиенко В. И., Джеллифф Р., Бондарева И. Б. Прикладная фармакокинетика: основные положения и клиническое применение М.: Издательство РАМН, 2003. 302 с. Sergienko VI, Gelliff R, Bondareva IB. Prikladnaya Pharmacokinetika. Moscow: Izdatelstvo RAMN, 2003. (In Russ.).Жердев В.П., Колыванов Г.Б., Литвин А.А., и др. Фармакокинетика дипептидного миметика BDNF ГСБ-106 у крыс. Фармакокинетика и фармакодинамика. 2019;1:37–43. DOI: 10.24411/2588-0519-2019-10038. Zherdev VP, Kolyvanov GB, Litvin AA, et al. Pharmacokinetics of dipeptide mimetic BDNF GSB-106 in rats. Farmakokinetika i farmakodinamika. 2019;1:37–43. (In Russ.). DOI: 10.24411/2588-0519-2019-10038.Жердев В.П., Колыванов Г.Б., Литвин А.А., и др. Фармакокинетика дипептидного миметика BDNF ГСБ-106 у крыс. Фармакокинетика и фармакодинамика. 2019;1:37–43. DOI: 10.24411/2588-0519-2019-10038. Zherdev VP, Kolyvanov GB, Litvin AA, et al. Pharmacokinetics of dipeptide mimetic BDNF GSB-106 in rats. Farmakokinetika i farmakodinamika. 2019;1:37–43. (In Russ.). DOI: 10.24411/2588-0519-2019-10038.Подолько А.Л., Бочков П.О., Литвин А.А., и др. Кинетика распределения нового нейропротекторного средства ГЗК-111 и его активного метаболита цикло-L-пролилглицина в органах и тканях крыс. Экспер. и клин. фармакол. 2022;85(7):32–35. DOI: 10.30906/0869-2092-2022-85-7-32-35. Podol’ko AL, Bochkov PO, Litvin AA, et al. Distribution kinetics of new neuroprotector compound GZK-111 and its metabolite cyclo-L-prolylglycyne n rat tissues and organs. Exper Clin Pharmacol. 2022;85(7):32–35. (In Russ.). DOI: 10.30906/0869-2092-2022-85-7-32-35Подолько А.Л., Бочков П.О., Литвин А.А., и др. Кинетика распределения нового нейропротекторного средства ГЗК-111 и его активного метаболита цикло-L-пролилглицина в органах и тканях крыс. Экспер. и клин. фармакол. 2022;85(7):32–35. DOI: 10.30906/0869-2092-2022-85-7-32-35. Podol’ko AL, Bochkov PO, Litvin AA, et al. Distribution kinetics of new neuroprotector compound GZK-111 and its metabolite cyclo-L-prolylglycyne n rat tissues and organs. Exper Clin Pharmacol. 2022;85(7):32–35. (In Russ.). DOI: 10.30906/0869-2092-2022-85-7-32-35

The authors declare that there are no conflicts of interest present.