phkineticaФармакокинетика и ФармакодинамикаPharmacokinetics and Pharmacodynamics2587-78362686-8830ООО «Издательство ОКИ»10.37489/2587-7836-2023-2-60-68phkinetica-373Research ArticleМЕТОДЫ ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙMETHODS OF PHARMACOKINETIC STUDIESМетодика количественного анализа маркерного субстрата ABCB1-белка фексофенадина в лизате клеток Caco-2Method for quantitative analysis of the marker substrate ABCB1-protein fexofenadine in Caco-2 cell lysatehttps://orcid.org/0000-0001-7476-4538КопаницаМ. А.KopanitsaM. A.

Копаница Мария Андреевна - ассистент кафедры фармацевтической химии

Рязань

Maria A. Kopanitsa - Assistant of the Department of Pharmaceutical chemistry

Ryazan

kopanitsa412@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5068-1201ТрановаЮ. С.TranovaYu. S.

Транова Юлия Сергеевна - ассистент кафедры фармацевтической химии

Рязань

Yulia S. Tranova - Assistant of the Department of Pharmaceutical chemistry

Ryazan

yulyatran@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-5618-7607ЧерныхИ. В.ChernykhI. V.

Черных Иван Владимирович - заведующий кафедрой фармацевтической химии, д.б.н., доц.

Рязань

Ivan V. Chernykh - Head of the Department of Pharmaceutical Chemistry, Dr. Sci. (Biol.), Associate Professor

Ryazan

ivchernykh88@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1688-0017ЩулькинА. В.ShchulkinA. V.

Щулькин Алексей Владимирович - профессор кафедры фармакологии, д.м.н., доц.

Рязань

Alexey V. Shchulkin - Professor of the Department of Pharmacology, Dr. Sci. (Med), Associate Professor

Ryazan

alekseyshulkin@rambler.ruhttps://orcid.org/0000-0001-7829-2494МыльниковП. Ю.MylnikovP. Yu.

Мыльников Павел Юрьевич - ассистент кафедры фармакологии, к.б.н.

Рязань

Pavel Yu. Mylnikov - Assistant of the Department of Pharmacology, Cand. Sci. (Biol.)

Ryazan

pavelmylnikov@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4005-4076КалинкинаО. В.KalinkinaO. V.

Калинкина Оксана Владимировна - старший преподаватель кафедры фармацевтической химии

Рязань

Oksana V. Kalinkina - Senior Lecturer, Department of Pharmaceutical Chemistry

Ryazan

kalinkina.oksanka@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6887-4888ЯкушеваЕ. Н.YakushevaE. N.

Якушева Елена Николаевна - заведующий кафедрой фармакологии, д.м.н., проф.

Рязань

Elena N. Yakusheva - Head of the Department of Pharmacology, Dr. Sci. (Med), Professor

Ryazan

enya.rzn@yandex.ruФГБОУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияRyazan State Medical UniversityRussian Federation202320072023026068Copyright © Копаница М.А., Транова Ю.С., Черных И.В., Щулькин А.В., Мыльников П.Ю., Калинкина О.В., Якушева Е.Н., 20232023Копаница М.А., Транова Ю.С., Черных И.В., Щулькин А.В., Мыльников П.Ю., Калинкина О.В., Якушева Е.Н.Kopanitsa M.A., Tranova Y.S., Chernykh I.V., Shchulkin A.V., Mylnikov P.Y., Kalinkina O.V., Yakusheva E.N.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.pharmacokinetica.ru/jour/article/view/373

Один из способов анализа активности ABCB1-белка — это оценка накопления его субстрата фексофенадина (Ф.) внутри тест-клеток. Цель — разработка и валидация методики количественного анализа Ф. в лизате клеток Caco-2 с помощью ВЭЖХ-МС/МС. Материалы и методы. В качестве матрицы использовался лизат клеток Caco-2. Анализ выполняли на хроматографе «Ultimate 3000» с тройным квадрупольным масс-детектором TSQ Fortis, колонкой UCT Selectra C18 4,6 мм×100 мм 5 мкм в градиентном режиме элюирования. Скорость подвижной фазы — 0,3 мл/мин, объём пробы — 20 мкл, режим ионизации — положительный, внутренний стандарт — амантадин (нг/мл). Пробоподготовка — осаждение белка лизата клеток ацетонитрилом. Методику валидировали по параметрам: селективность, линейность, нижний предел количественного определения (НПКО), правильность, прецизионность, перенос пробы и стабильность образцов. Результаты. На хроматограммах холостого лизата клеток Caco-2 не было пиков со временем удерживания, характерным для Ф. (5,70 мин) и амантадина (3,58 мин). НПКО Ф. составил 0,5 нг/мл. Перенос Ф. не превышал 20 % НПКО, а амантадина — 5 %. По результатам анализа трёх серий градуировочных стандартов (0,5; 1; 1,5; 5; 10; 25; 40; 50 нг/мл) получены уравнения линейной регрессии, коэффициенты корреляции превышали 0,99. Правильность и прецизионность оценивали внутри и между циклами, выполняя анализ растворов Ф. в матрице (0,5; 1,5; 25 и 40 нг/мл) в рамках трёх циклов. Параметры не превышали 20 % для НПКО и 15 % — для остальных точек. Стабильность растворов Ф. (1,5 и 40 нг/мл) в лизате анализировали при хранении при комнатной температуре, после 3-кратной заморозки–разморозки, хранении при -80 °С 60 сут., после пробоподготовки и нахождения в автосемплере 24 ч. Правильность находилась в пределах 15 % от номинальных значений. Выводы. Разработана и валидирована методика количественного определения Ф. в лизате клеток Caco-2 с помощью ВЭЖХ-МС/МС.

One way to analyze the activity of the ABCB1 protein is to assess the accumulation of its substrate fexofenadine (F.) inside the test cells. The goal is to develop and validate a method for the quantitative analysis of F. in Caco-2 cell lysate using HPLC-MS/MS. Materials and methods. Caco-2 cell lysate was used as a matrix. The analysis was performed on an "Ultimate 3000" chromatograph with a TSQ Fortis triple quadrupole mass detector, a UCT Selectra C18 4.6 mm*100 mm 5 µm column in a gradient elution mode. The mobile phase rate was 0.3 ml/min, the sample volume was 20 µl, the ionization mode was positive, and the internal standard was amantadine (ng/ml). Sample preparation — precipitation of cell lysate protein with acetonitrile. The method was validated for the following parameters: selectivity, linearity, lower limit of quantitation (LLOQ), correctness, precision, sample transfer and sample stability. Results. Chromatograms of the blank lysate of Caco-2 cells showed no peaks with retention times characteristic of F. (5.70 min) and amantadine (3.58 min). NPKO F. was 0.5 ng/ml. F.'s transfer did not exceed 20% of NPKO, and amantadine — 5%. Based on the results of the analysis of three series of calibration standards (0.5; 1; 1.5; 5; 10; 25; 40; 50 ng/ml), linear regression equations were obtained, the correlation coefficients exceeded 0.99. Accuracy and precision were assessed within and between cycles by analyzing F. solutions in the matrix (0.5; 1.5; 25 and 40 ng/ml) within three cycles. The parameters did not exceed 20% for LLPO and 15% for other points. The stability of F. solutions (1.5 and 40 ng/ml) in the lysate was analyzed during storage at room temperature, after 3-fold freezing-thawing, storage at -80 °C for 60 days, after sample preparation and being in the autosampler for 24 hours. The accuracy was within 15% of the nominal values. Conclusions. A method for the quantitative determination of F. in Caco-2 cell lysate using HPLC-MS/MS has been developed and validated.

ВЭЖХ-МС/МСфексофенадинABCB1-белоклизат клеток Caco-2HPLC-MS/MSfexofenadineABCB1 proteinCaco-2 cell lysateРабота поддержана стипендией Президента Российской Федерации молодым учёным и аспирантам (Конкурс СП-2022) (приказ Минобрнауки России от 20.01.2022 №38).The work was supported by the scholarship of the President of the Russian Federation for young scientists and postgraduates (SP-2022 Competition) (Order of the Ministry of Education and Science of the Russian Federation No. 38 dated 20.01.2022).ReferencesSpudich A, Kilic E, Xing H, et al. Inhibition of multidrug resistance transporter-1 facilitates neuroprotective therapies after focal cerebral ischemia. Nat Neurosci. 2006 Apr;9(4):487–8. DOI: 10.1038/nn1676.Spudich A, Kilic E, Xing H, et al. Inhibition of multidrug resistance transporter-1 facilitates neuroprotective therapies after focal cerebral ischemia. Nat Neurosci. 2006 Apr;9(4):487–8. DOI: 10.1038/nn1676.Черных И.В., Щулькин А.В., Якушева Е.Н., Попова Н.М. Роль гликопротеина-Р в неврологии. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2017;117(1):67–71. [Chernykh IV, Shchulkin AV, Yakusheva EN, Popova NM. A role of P-glycoprotein in neurology. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 2017;117(1):67–71. (In Russ).]. DOI: 10.17116/jnevro20171171167-71.Черных И.В., Щулькин А.В., Якушева Е.Н., Попова Н.М. Роль гликопротеина-Р в неврологии. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2017;117(1):67–71. [Chernykh IV, Shchulkin AV, Yakusheva EN, Popova NM. A role of P-glycoprotein in neurology. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 2017;117(1):67–71. (In Russ).]. DOI: 10.17116/jnevro20171171167-71.Сычев Д.А., Кукес В.Г., Каркищенко Н.Н. Методические рекомендации по изучению биотрансформации и транспортеров новых лекарственных средств: дизайн исследований, анализ данных: руководство по экспертизе лекарственных средств. М.: Гриф и К; 2014. [Sychev DA, Kukes VG, Karkishhenko NN. Metodicheskie rekomendacii po izucheniyu biotransformacii i transporterov novy`x lekarstvenny`x sredstv: dizajn issledovanij, analiz danny`x: rukovodstvo po e`kspertize lekarstvenny`x sredstv. Moscow: Grif i K; 2014. (In Russ).].Сычев Д.А., Кукес В.Г., Каркищенко Н.Н. Методические рекомендации по изучению биотрансформации и транспортеров новых лекарственных средств: дизайн исследований, анализ данных: руководство по экспертизе лекарственных средств. М.: Гриф и К; 2014. [Sychev DA, Kukes VG, Karkishhenko NN. Metodicheskie rekomendacii po izucheniyu biotransformacii i transporterov novy`x lekarstvenny`x sredstv: dizajn issledovanij, analiz danny`x: rukovodstvo po e`kspertize lekarstvenny`x sredstv. Moscow: Grif i K; 2014. (In Russ).].Clinical Drug Interaction Studies — Cytochrome P450 Enzyme- and Transporter-Mediated Drug Interactions Guidance for Industry. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Clinical Pharmacology. (2020).Clinical Drug Interaction Studies — Cytochrome P450 Enzyme- and Transporter-Mediated Drug Interactions Guidance for Industry. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Clinical Pharmacology. (2020).In Vitro Drug Interaction Studies — Cytochrome P450 Enzyme- and Transporter-Mediated Drug Interactions Guidance for Industry. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Clinical Pharmacology. (2020).In Vitro Drug Interaction Studies — Cytochrome P450 Enzyme- and Transporter-Mediated Drug Interactions Guidance for Industry. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Clinical Pharmacology. (2020).Sambuy Y, De Angelis I, Ranaldi G, et al. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 2005 Jan;21(1):1-26. DOI: 10.1007/s10565-005-0085-6.Sambuy Y, De Angelis I, Ranaldi G, et al. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 2005 Jan;21(1):1-26. DOI: 10.1007/s10565-005-0085-6.Щулькин А.В., Транова Ю.С., Абаленихина Ю.В., и др. Клетки линии Сaco-2 как модель для изучения абсорбции лекарственных веществ. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2022;(10):63–69. [Shchulkin AV, Tranova YuS, Abalenikhina YuV, et al. Cells of the Caco-2 line as a model for studying the absorption of medicinal substances. Experimental and Clinical Gastroenterology. 2022;(10):63–69. (In Russ).]. DOI: 10.31146/1682-8658-ecg-206-10-63-69.Щулькин А.В., Транова Ю.С., Абаленихина Ю.В., и др. Клетки линии Сaco-2 как модель для изучения абсорбции лекарственных веществ. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2022;(10):63–69. [Shchulkin AV, Tranova YuS, Abalenikhina YuV, et al. Cells of the Caco-2 line as a model for studying the absorption of medicinal substances. Experimental and Clinical Gastroenterology. 2022;(10):63–69. (In Russ).]. DOI: 10.31146/1682-8658-ecg-206-10-63-69.Pilařová V, Gottvald T, Svoboda P, et al. Development and optimization of ultra-high performance supercritical fluid chromatography mass spectrometry method for high-throughput determination of tocopherols and tocotrienols in human serum. Anal Chim Acta. 2016 Aug 31;934:252–65. DOI: 10.1016/j.aca.2016.06.008.Pilařová V, Gottvald T, Svoboda P, et al. Development and optimization of ultra-high performance supercritical fluid chromatography mass spectrometry method for high-throughput determination of tocopherols and tocotrienols in human serum. Anal Chim Acta. 2016 Aug 31;934:252–65. DOI: 10.1016/j.aca.2016.06.008.Oliveira DC, Weigch A, Rolim CM. Simple and reliable HPLC analysis of fexofenadine hydrochloride in tablets and its application to dissolution studies. Pharmazie. 2007 Feb;62(2):96–100.Oliveira DC, Weigch A, Rolim CM. Simple and reliable HPLC analysis of fexofenadine hydrochloride in tablets and its application to dissolution studies. Pharmazie. 2007 Feb;62(2):96–100.Мыльников П.Ю., Черных И.В., Щулькин А.В., Попова Н.М., Якушева Е.Н. ВЭЖХ-методика количественного анализа фексофенадина в печени кроликов. Фармация и фармакология. 2020;8(1):40–47. [Mylnikov PYu, Chernykh IV, Shchulkin AV, Popova NM, Yakusheva EN. HPLC methods of fexofenadine quantitative analysis in rabbits’ liver. Pharmacy & Pharmacology. 2020;8(1):40–47. (In Russ).]. DOI: 10.19163/2307-9266-2020-8-1-40-47.Мыльников П.Ю., Черных И.В., Щулькин А.В., Попова Н.М., Якушева Е.Н. ВЭЖХ-методика количественного анализа фексофенадина в печени кроликов. Фармация и фармакология. 2020;8(1):40–47. [Mylnikov PYu, Chernykh IV, Shchulkin AV, Popova NM, Yakusheva EN. HPLC methods of fexofenadine quantitative analysis in rabbits’ liver. Pharmacy & Pharmacology. 2020;8(1):40–47. (In Russ).]. DOI: 10.19163/2307-9266-2020-8-1-40-47.Якушева Е.Н., Черных И.В., Щулькин А.В., Гацанога М.В. Разработка ВЭЖХ-методики количественного анализа фексофенадина в плазме крови. Фармакокинетика и Фармакодинамика. 2017;(2):35–38. [Yakusheva EN, Chernykh IV, Shulkin AV, Gatsanoga MV. Design of HPLC methods of fexofenadine quantitative analysis in blood plasma. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. 2017;(2):35–38. (In Russ).].Якушева Е.Н., Черных И.В., Щулькин А.В., Гацанога М.В. Разработка ВЭЖХ-методики количественного анализа фексофенадина в плазме крови. Фармакокинетика и Фармакодинамика. 2017;(2):35–38. [Yakusheva EN, Chernykh IV, Shulkin AV, Gatsanoga MV. Design of HPLC methods of fexofenadine quantitative analysis in blood plasma. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. 2017;(2):35–38. (In Russ).].İşleyen EAÖ, Özden T, Özilhan S, Toptan S. Quantitative determination of fexofenadine in human plasma by HPLC-MS. Chromatographia. 2007;(66):109–113. DOI: 10.1365/s10337-007-0267-x.İşleyen EAÖ, Özden T, Özilhan S, Toptan S. Quantitative determination of fexofenadine in human plasma by HPLC-MS. Chromatographia. 2007;(66):109–113. DOI: 10.1365/s10337-007-0267-x.Zhao R, Kalvass JC, Yanni SB, Bridges AS, Pollack GM. Fexofenadine brain exposure and the influence of blood-brain barrier P-glycoprotein after fexofenadine and terfenadine administration. Drug Metab Dispos. 2009 Mar;37(3):529–35. DOI: 10.1124/dmd.107.019893.Zhao R, Kalvass JC, Yanni SB, Bridges AS, Pollack GM. Fexofenadine brain exposure and the influence of blood-brain barrier P-glycoprotein after fexofenadine and terfenadine administration. Drug Metab Dispos. 2009 Mar;37(3):529–35. DOI: 10.1124/dmd.107.019893.Flynn CA, Alnouti Y, Reed GA. Quantification of the transporter substrate fexofenadine in cell lysates by liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 2011 Aug 30;25(16):2361–6. DOI: 10.1002/rcm.5111.Flynn CA, Alnouti Y, Reed GA. Quantification of the transporter substrate fexofenadine in cell lysates by liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 2011 Aug 30;25(16):2361–6. DOI: 10.1002/rcm.5111.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.