phkineticaФармакокинетика и ФармакодинамикаPharmacokinetics and Pharmacodynamics2587-78362686-8830ООО «Издательство ОКИ»10.37489/2587-7836-2022-2-46-57phkinetica-318Research ArticleМЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ В БИОМАТЕРИАЛЕMETHODS FOR DETERMINATION OF DRUGS IN BIOLOGICAL MATERIALРазработка подходов для исследования биораспределения бицистронной терапевтической плазмидной конструкции в организме мышиDevelopment of approaches for studying the biodistribution of a bicistronic therapeutic plasmid construct in the mouse bodyhttps://orcid.org/0000-0001-5480-2322ДжауариС. С.DzhauariS. S.

Джауари Сталик Станиславович, аспирант кафедры биохимии и молекулярной медицины, ФФМ. SPIN-код: 6990-3656

Москва

Dzhauari Stalik S., PhD student of the Department of Biochemistry and Molecular Medicine, Faculty of Medicine. SPIN code: 6990-3656

Moscow

stalik.djauari@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0003-4289-3428КарагяурМ. Н.KaragyaurM. N.

Карагяур Максим Николаевич, к. б. н., доцент кафедры биохимии и молекулярной медицины, ФФМ; с. н. с. ИРМ МНОЦ. SPIN-код: 9504-4257

Москва

Karagyaur Maxim N., PhD Biological Sci., Associate Professor, Department of Biochemistry and Molecular Medicine, Faculty of Medicine; senior researcher Institute for Regenerative Medicine, Medical research and education center. SPIN code: 9504-4257

Moscow

m.karagyaur@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5744-7060БалабаньянВ. Ю.BalabanyanV. Yu.

Балабаньян Вадим Юрьевич, д. фарм. н., в. н. с., межфакультетская научно-исследовательская лаборатория трансляционной медицины ФФМ; в. н. с. ИРМ МНОЦ

Москва

Balabanyan Vadim Yu., Doctor of Pharmacy, Leading Researcher, Interfaculty Research Laboratory of Translational Medicine, Faculty of Medicine; Leading Researcher, Institute for Regenerative Medicine, Medical research and education center

Moscow

bal.pharm@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3128-2699СкрябинаМ. Н.SkryabinaM. N.

Скрябина Мария Никитична, студент, лаборант кафедры биохимии и молекулярной медицины, ФФМ

Москва

Skryabina Mariya N., Student, laboratory assistant of the Department of Biochemistry and Molecular Medicine, Faculty of Medicine

Moscow

skrebbka@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-1386-5922ПримакА. Л.PrimakA. L.

Примак Александра Леонидовна, аспирант кафедры биохимии и молекулярной медицины ФФМ. SPIN-код: 3882-8197

Москва

Primak Alexandra L., PhD student of the Department of Biochemistry and Molecular Medicine, Faculty of Medicine. SPIN code: 3882-8197

Moscow

primak.msu@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6983-9697СтамбольскийД. В.StambolskyD. V.

Стамбольский Дмитрий Викторович, к. б. н., в. н. с. отдела научных программ и инновационных технологий медицинского научно-образовательного центра. SPIN-код: 1776-1518

Москва

Stambolsky Dmitry V., PhD Biological Sci., Leading Researcher, Department of Scientific Programs and Innovative Technologies of the Medical Research and Education Center. SPIN code: 1776-1518

Moscow

dstambolsky@mc.msu.ruФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»РоссияLomonosov Moscow State UniversityRussian Federation202206072022024657Copyright © Джауари С.С., Карагяур М.Н., Балабаньян В.Ю., Скрябина М.Н., Примак А.Л., Стамбольский Д.В., 20222022Джауари С.С., Карагяур М.Н., Балабаньян В.Ю., Скрябина М.Н., Примак А.Л., Стамбольский Д.В.Dzhauari S.S., Karagyaur M.N., Balabanyan V.Y., Skryabina M.N., Primak A.L., Stambolsky D.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.pharmacokinetica.ru/jour/article/view/318

Актуальность. Применение генотерапевтических препаратов для лечения генетических заболеваний и стимуляции процессов регенерации является длительным и подразумевает осуществление повторных инъекций, что может привести к усилению диссеминации генотерапевтических конструкций из области введения и нежелательной эктопической экспрессии закодированных в них ростовых факторов. Существующие подходы по изучению фармакокинетики лекарственного препарата для оценки диссеминации генотерапевтического препарата из очага введения неприменимы. Цель: оценить пригодность метода ПЦР в реальном времени для изучения биораспределения перспективного генотерапевтического препарата в организме мыши при курсовом применении. Методы. Самцам мышей F1 CBA×C57/Black делали инъекции исследуемой плазмиды в денервированную большеберцовую мышцу после травмы нерва, а также через 4, 9 и 13 дней в дозировке 60 и 120 мкг/мышь. Через 7, 14 и 28 дней после окончания курса инъекций образцы органов и тканей изымали, тотальную ДНК выделяли, и содержание плазмидной ДНК оценивали с помощью ПЦР в реальном времени. Результаты. Было показано, что изученная генетическая конструкция способна диссеминировать из области введения. Было установлено, что пик диссеминации для данной конструкции в органах и тканях мыши достигается через 14–28 суток после окончания курсового применения, при этом эктопической экспрессии факторов роста в них не наблюдается. Заключение. Предложенный метод является специфичным, высокочувствительным и линеен в широком диапазоне концентраций. Таким образом, он может быть рекомендован для изучения биораспределения потенциальных генотерапевтических препаратов в организме экспериментальных животных в рамках комплекса доклинических исследований.

Relevance. The use of gene therapy drugs for the treatment of genetic diseases and stimulation of regeneration processes is lengthy and involves repeated injections, which may lead to increased dissemination of gene therapy constructs from the injection site and undesirable ectopic expression of growth factors encoded in them. Existing approaches to study the pharmacokinetics of a drug to assess the dissemination of a gene therapy drug from the site of administration are not applicable. Objective: to evaluate the suitability of the real-time PCR method for studying the biodistribution of a promising gene therapy drug in mice during a course of use. Methods. Male F1 CBA×C57/Black mice after nerve injury were injected with the test plasmid into the denervated tibial muscle after nerve injury, as well as after 4, 9 and 13 days at a dosage of 60 and 120 μg/mouse. After 7, 14, and 28 days, organ and tissue samples were removed, total DNA was isolated, and plasmid DNA content was assessed by real-time PCR. Results. We have shown that the studied genetic construct is able to disseminate from the injection site. We have found that the peak of dissemination for this construct in the organs and tissues of the mouse is reached 14–28 days after the end of the course application, while ectopic expression of growth factors is not observed in them. Conclusion. The proposed method is specific, highly sensitive, and linear over a wide range of concentrations. Thus, it can be recommended for studying the biodistribution of potential gene therapy drugs in the body of experimental animals as part of a preclinical studies complex.

генная терапияплазмидадиссеминацияПЦР в реальном временимышиgene therapyplasmiddisseminationRealTime PCRmiceРабота выполнена при финасовой поддержке МинПромТорга РФ в рамках реализации Федеральной целевой программы «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу».The study was financially supported by the Ministry of Industry and Trade of the Russian Federation as part of the implementation of the Federal target program “Development of the pharmaceutical and medical industries of the Russian Federation for the period up to 2020 and beyond”.ReferencesОдинак М.М., Живолупов С.А. Заболевания и травмы периферической нервной системы. Санкт-Петербург: Издательство «СпецЛит»; 2009.Odinak MM, Zhivolupov SA. Zabolevaniya i travmy perifericheskoj nervnoj sistemy. Saint-Petersburg: Izdatel'stvo «SpecLit»; 2009. (In Russ).Шевелев И.Н. Травматические поражения плечевого сплетения. – М.: Издательство «Москва»; 2005.Shevelev IN. Travmaticheskie porazheniya plechevogo spleteniya. Moscow: Izdatel'stvo «Moskva»; 2005. (In Russ).Karagyaur M, Rostovtseva A, Semina E, Klimovich P et al. A bicistronic plasmid encoding brain-derived neurotrophic factor and urokinase plasminogen activatorstimulates peripheral nerve regeneration after injury. J Pharmacol Exp Ther. 2020;372(3):248–255. DOI: 10.1124/jpet.119.261594.Karagyaur M, Rostovtseva A, Semina E, Klimovich P et al. A bicistronic plasmid encoding brain-derived neurotrophic factor and urokinase plasminogen activatorstimulates peripheral nerve regeneration after injury. J Pharmacol Exp Ther. 2020;372(3):248–255. DOI: 10.1124/jpet.119.261594.Boyd JG, Gordon T. Neurotrophic factors and their receptors in axonal regeneration and functional recovery after peripheral nerve injury. Mol Neurobiol. 2003;27(3):277–324. DOI: 10.1385/MN:27:3:277.Boyd JG, Gordon T. Neurotrophic factors and their receptors in axonal regeneration and functional recovery after peripheral nerve injury. Mol Neurobiol. 2003;27(3):277–324. DOI: 10.1385/MN:27:3:277.Frostick SP, Yin Q, Kemp GJ. Schwann cells, neurotrophic factors, and peripheral nerve regeneration. Microsurgery. 1998;18(7):397–405. DOI: 10.1002/(sici)1098-2752(1998)18:7<397::aid-micr2>3.0.co;2-f.Frostick SP, Yin Q, Kemp GJ. Schwann cells, neurotrophic factors, and peripheral nerve regeneration. Microsurgery. 1998;18(7):397–405. DOI: 10.1002/(sici)1098-2752(1998)18:7<397::aid-micr2>3.0.co;2-f.Huang Q, Wei H, Wu Z, et al. Preferentially Expressed Antigen of Melanoma Prevents Lung Cancer Metastasis. PLoS One. 2016;11(7):e0149640. DOI: 10.1371/journal.pone.0149640.Huang Q, Wei H, Wu Z, et al. Preferentially Expressed Antigen of Melanoma Prevents Lung Cancer Metastasis. PLoS One. 2016;11(7):e0149640. DOI: 10.1371/journal.pone.0149640.Maripuu A, Björkman A, Björkman-Burtscher IM, Mannfolk P et al. Reconstruction of sciatic nerve after traumatic injury in humans - factors influencing outcome as related to neurobiological knowledge from animal research. J Brachial Plex Peripher Nerve Inj. 2012 Oct 10;7(1):7. DOI: 10.1186/1749-7221-7-7.Maripuu A, Björkman A, Björkman-Burtscher IM, Mannfolk P et al. Reconstruction of sciatic nerve after traumatic injury in humans - factors influencing outcome as related to neurobiological knowledge from animal research. J Brachial Plex Peripher Nerve Inj. 2012 Oct 10;7(1):7. DOI: 10.1186/1749-7221-7-7.EMEA. Guideline on bioanalytical method validation. 2011.EMEA. Guideline on bioanalytical method validation. 2011.US FDA. Guidance for industry: Q2B validation of analytical procedures: methodology. Rockville. MD: Nov 1996.US FDA. Guidance for industry: Q2B validation of analytical procedures: methodology. Rockville. MD: Nov 1996.OECD. Guidance document on the validation and international acceptance of new or updated test methods for hazard assessment. 2005.OECD. Guidance document on the validation and international acceptance of new or updated test methods for hazard assessment. 2005.Schechtman LM. Internationally harmonized processes for test method evaluation. Validation and regulatory acceptance: The role of OECD guidance document 34. Japanese Society for Alternatives to Animal Experiments, 14, Special Issue. Рр. 475–782 (2008).Schechtman LM. Internationally harmonized processes for test method evaluation. Validation and regulatory acceptance: The role of OECD guidance document 34. Japanese Society for Alternatives to Animal Experiments, 14, Special Issue. Рр. 475–782 (2008).Хамиде З. Сеньюва, Гилберт Д. Простое руководство для пользователей по разработке и валидации методов / Перевод на русский язык под ред. А. Галкин. – М.: Издательство «ООО Ториус 77»; 2011.Hamide Z. Senyuva, Gilbert D. Prostoe rukovodstvo dlya pol'zovatelej po razrabotke i validacii metodov / Perevod na russkij yazyk pod red. A. Galkin. Moscow: Izdatel'stvo «OOO Torius 77»; 2011. (In Russ).Ermer J, Nethercote PW. Method Validation in Pharmaceutical Analysis. Wiley, 2014.Ermer J, Nethercote PW. Method Validation in Pharmaceutical Analysis. Wiley, 2014.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.