phkineticaФармакокинетика и ФармакодинамикаPharmacokinetics and Pharmacodynamics2587-78362686-8830ООО «Издательство ОКИ»10.37489/2587-7836-2021-1-45-51phkinetica-271Research ArticleМЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ В БИОМАТЕРИАЛЕMETHODS FOR DETERMINATION OF DRUGS IN BIOLOGICAL MATERIALРазработка и валидация методики количественного определения метотрексата в транспортной среде методом ВЭЖХ-МC/МСDevelopment and validation of the method for the quantitative determination of methotrexate in a transport medium by HPLC-MS/MShttps://orcid.org/0000-0001-7829-2494МыльниковП. Ю.MylnikovP. Yu.

Мыльников Павел Юрьевич, ассистент кафедры фармакологии с курсом фармации факультета дополнительного профессионального образования

SPIN-код: 8503-3082

Рязань 

Mylnikov Pavel Yu., assistant of the Department of Pharmacology with the course of Pharmacy of the Faculty of Additional Professional Education

SPIN code: 8503-3082

Ryazan 

dukeviperlr@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0001-5068-1201ТрановаЮ.TranovaYu.

Транова Юлия, очный аспирант кафедры фармакологии с курсом фармации факультета дополнительного профессионального образования

Рязань 

Tranova Julia, full-time postgraduate student of the Department of Pharmacology with the course of Pharmacy of the Faculty of Additional Professional Education

Ryazan 

yulyatran@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0003-1688-0017ЩулькинА. В.ShchulkinA. V.

Щулькин Алексей Владимирович, д. м. н., профессор, доцент кафедры фармакологии с курсом фармации факультета дополнительного профессионального образования

SPIN-код: 2754-1702

Рязань 

Shchulkin Alexey V., Dr. Sci. (Med.), Professor, associate Professor of the Department of Pharmacology with the course of Pharmacy of the Faculty of Additional Professional Education

SPIN code: 2754-1702

Ryazan 

alekseyshulkin@rambler.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6887-4888ЯкушеваЕ. Н.YakushevaE. N.

Якушева Елена Николаевна, д. м. н., профессор, зав. кафедрой фармакологии с курсом фармации факультета дополнительного профессионального образования

SPIN-код: 2865-3080

Рязань 

Yakusheva Elena N., Dr. Sci. (Med.), Professor, Head of the Department of Pharmacology with the course of Pharmacy of the Faculty of Additional Professional Education

SPIN code: 2865-3080

Ryazan 

e.yakusheva@rzgmu.ruФГБОУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияFSBEI HE "I.P. Pavlov Ryazan State Medical University" of the Ministry of Healthcare of the Russian FederationRussian Federation202127092021014551Copyright © Мыльников П.Ю., Транова Ю., Щулькин А.В., Якушева Е.Н., 20212021Мыльников П.Ю., Транова Ю., Щулькин А.В., Якушева Е.Н.Mylnikov P.Y., Tranova Y., Shchulkin A.V., Yakusheva E.N.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.pharmacokinetica.ru/jour/article/view/271

Актуальность. BCRP – эффлюксный белок-транспортёр, играющий важную роль в фармакокинетике широкого спектра лекарственных веществ. Активность BCRP в опытах in vitro оценивается по транспорту субстратов белка-транспортёра (метотрексата и др.) через билипидную мембрану клеток, гиперэкспрессирующих BCRP, например, клетках линии Caco-2. Цель: разработать и валидировать методику количественного определения субстрата BCRP – метотрексата в транспортной среде клеток линии Caco-2 методом ВЭЖХ-МС/МС. Методы исследования. Работа выполнена на ВЭЖХ-хроматографе «Ultimate 3000» («ThermoFisher», США) с тандемным масс-селективным детектором TSQ Fortis («ThermoFisher», США). Условия хроматографического анализа были следующими: колонка UCT Selectra C18 4,6 mm ×100 mm 5um, 100A, предколонка Selectra C18 Guard Cartridges SLC-18GDC46-5UM, температура разделения – 35 °С, скорость потока – 0,3 мл/мин, объём вводимой пробы – 2 мкл, время анализа – 10 мин. Использовали градиентный режим элюирования: соотношение раствора 0,1 % муравьиной кислоты и ацетонитрила составило на 0 мин 75 и 25 %; 0,4 мин – 60 и 40 %; 6 мин – 20 и 80 %; 8 мин – 75 и 25 %. В данных условиях время удерживания метотрексата – 3,11 мин. Условия детектирования: метотрексат – положительный режим ионизации, 455,15 m/z → 308,125 m/z, энергия столкновения – 22,99 В, фрагментация источника – 5, давление CID-газа – 2 мТорр. Извлечение метотрексата из транспортной среды (раствор Хэнкса с 25 мМ Хепес и 1 % диметилсульфоксида) после инкубирования с клетками линии Сaco-2 в течение 3 ч осуществляли смесью метанол+вода в соотношении 1:1. Результаты. Разработанная методика была валидирована по следующим параметрам: селективность, линейность, точность, прецизионность, предел количественного определения, перенос пробы, стабильность образцов. Подтверждённый аналитический диапазон методики составил 60–10 000 нмоль/л в транспортной среде. Выводы: разработана и валидирована методика количественного определения метотрексата в транспортной среде клеток линии Caco-2 методом ВЭЖХ-МС/МС.

Relevance. BCRP is an efflux transporter protein that plays an important role in the pharmacokinetics of a wide range of drugs. The BCRP activity in vitro experiments is assessed by the transport of transporter protein substrates (methotrexate, etc.) across the bilipid membrane of cells overexpressingBCRP, for example, Caco-2 cells. The aim is to develop and validate a method for the quantitative determination of the BCRP substrate, methotrexate, in the transport medium of Caco-2 cells by HPLC-MS/MS. Methods. The work was performed on an Ultimate 3000 HPLC chromatograph (ThermoFisher, USA) with a TSQ Fortis tandem mass-selective detector (ThermoFisher, USA). The conditions of chromatographic analysis were as follows: column UCT Selectra C18 4.6 mm * 100 mm 5um, 100A, Selectra C18 Guard Cartridges SLC-18GDC46-5UM, separation temperature 35 °С, flow rate 0.3 ml/min, injected sample volume - 2 μl, analysis time - 10 min. Used a gradient elution: the ratio of the solution of 0.1 % formic acid and acetonitrile was at 0 min 75 and 25 %; 0.4 min 60 and 40 %; 6 minutes 20 and 80 %; 8 minutes 75 and 25 %. Under these conditions, the retention time of methotrexate is 3.11 minutes. Detection conditions: methotrexate - positive ionization mode, 455.15 m / z → 308.125 m / z, collision energy 22.99 V, source fragmentation 5, CID gas pressure 2 mTorr. The extraction of methotrexate from the transport medium (Hanks solution with 25 mM Hepes and 1% dimethyl sulfoxide) after incubation with Caco-2 cells for 3 h was carried out with a mixture of methanol + water in a ratio of 1: 1. Results. The developed method was validated according to the following parameters: selectivity, linearity, accuracy, precision, limit of quantitative determination, sample transfer, sample stability. The confirmed analytical range of the method was 60 -10,000 nmol / L in the transport medium. Conclusions: a method for the quantitative determination of methotrexate in the transport medium of Caco-2 cells by HPLC-MS / MS was developed and validated.

метотрексатВЭЖХ-МС/МСклетки линии Caco-2BCRPmethotrexateHPLC-MS/MSCaco-2 cellsBCRPReferencesDoyle LA, Yang W, Abruzzo LV, Krogmann T, Gao Y, Rishi AK, Ross DD. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1998;95(26):15665–15670. DOI: 10.1073/pnas.95.26.15665.Doyle LA, Yang W, Abruzzo LV, Krogmann T, Gao Y, Rishi AK, Ross DD. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1998;95(26):15665–15670. DOI: 10.1073/pnas.95.26.15665.Maliepaard M, Scheffer GL, Faneyte IF et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 2001;61(8):3458–3464.Maliepaard M, Scheffer GL, Faneyte IF et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 2001;61(8):3458–3464.Scheffer GL, Scheper RJ. Drug resistance molecules: lessons from oncology. Novartis Found Symp. 2002;243:19-31.Scheffer GL, Scheper RJ. Drug resistance molecules: lessons from oncology. Novartis Found Symp. 2002;243:19-31.Chen ZS, Robey RW, Belinsky MG et al. Transport of methotrexate, methotrexate polyglutamates, and 17beta-estradiol 17-(beta-D-glucuronide) by ABCG2: effects of acquired mutations at R482 on methotrexate transport. Cancer Res. 2003;63(14):4048–4054.Chen ZS, Robey RW, Belinsky MG et al. Transport of methotrexate, methotrexate polyglutamates, and 17beta-estradiol 17-(beta-D-glucuronide) by ABCG2: effects of acquired mutations at R482 on methotrexate transport. Cancer Res. 2003;63(14):4048–4054.U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Guidance for Industry Drug Interaction Studies – Study Design, Data Analysis, Implications for Dosing, and Labeling Recommendations, 2012, 75 P.U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Guidance for Industry Drug Interaction Studies – Study Design, Data Analysis, Implications for Dosing, and Labeling Recommendations, 2012, 75 P.U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER). In Vitro Drug Interaction Studies — Cytochrome P450 Enzyme- and TransporterMediated Drug Interactions Guidance for Industry, 2020, 43 P.U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER). In Vitro Drug Interaction Studies — Cytochrome P450 Enzyme- and TransporterMediated Drug Interactions Guidance for Industry, 2020, 43 P.Изучение биоэквивалентности воспроизведенных лекарственных средств. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Том I. – М.: Гриф и К; 2013. – 328 с. [Izuchenie bioekvivalentnosti vosproizvedennykh lekarstvennykh sredstv. Rukovodstvo po ekspertize lekarstvennykh sredstv. Tom I. Moscow: Grif i K; 2013. (In Russ).].Изучение биоэквивалентности воспроизведенных лекарственных средств. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Том I. – М.: Гриф и К; 2013. – 328 с. [Izuchenie bioekvivalentnosti vosproizvedennykh lekarstvennykh sredstv. Rukovodstvo po ekspertize lekarstvennykh sredstv. Tom I. Moscow: Grif i K; 2013. (In Russ).].Руководства по экспертизе лекарственных средств Том I, правил проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза, Совет Евразийской экономической комисси, решение от 3 ноября 2016 №85. [Rukovodstva po ekspertize lekarstvennykh sredstv Tom I, pravil provedeniya issledovanii bioekvivalentnosti lekarstvennykh preparatov v ramkakh Evraziiskogo ekonomicheskogo soyuza, Sovet Evraziiskoi ekonomicheskoi komissi, reshenie ot 3 noyabrya 2016 №85. (In Russ).]Руководства по экспертизе лекарственных средств Том I, правил проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза, Совет Евразийской экономической комисси, решение от 3 ноября 2016 №85. [Rukovodstva po ekspertize lekarstvennykh sredstv Tom I, pravil provedeniya issledovanii bioekvivalentnosti lekarstvennykh preparatov v ramkakh Evraziiskogo ekonomicheskogo soyuza, Sovet Evraziiskoi ekonomicheskoi komissi, reshenie ot 3 noyabrya 2016 №85. (In Russ).]U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evolution and Research (CDER). Bioanalytical method validation. U.S. Government Printing Office: Washington, DC, 2018, 41 P.U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evolution and Research (CDER). Bioanalytical method validation. U.S. Government Printing Office: Washington, DC, 2018, 41 P.ЕМА Guideline on bioanalytical method validation. European Medicines Agency. Committee for medicinal products for human use: London, 2011, 23 P.ЕМА Guideline on bioanalytical method validation. European Medicines Agency. Committee for medicinal products for human use: London, 2011, 23 P.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.