Нейропротекторные свойства in vitro новых замещённых глипролинов
Вт, 19 Фев 2019
391

Резюме. Ранее в НИИ фармакологии имени В.В. Закусова был сконструирован и синтезирован линейный замещенный глипролин ГЗК-111, этиловый эфир N-фенилацетил-глицил-L-пролина, способный превращаться в нейропептид цикло-пролилглицин (ЦПГ) в биологических средах и проявляющий характерные для последнего ноотропную, анксиолитическую, антигипоксическую и нейропротекторную активность. Цель данной работы состояла в изучении нейропротекторной активности аналогов замещённого глипролина ГЗК-111 по Cи N-концу in vitro на модели оксидативного стресса в сравнении с ЦПГ. Оксидативный стресс, вызванный Н2О2 (1,5 мM), приводил к достоверному снижению жизнеспособности гиппокампальных клеток линии НТ-22. L-ЦПГ защищал клетки от повреждения Н2О2 в концентрациях до 10-7М при внесении как за 24 ч до, так и сразу после повреждения. Соединение с открытой карбоксильной группой (ГЗК-115) защищало клетки НТ-22 от гибели, подобно L-ЦПГ, в обеих схемах эксперимента в концентрациях до 10-7М. Замещённый амид ГЗК-119, внесённый за 24 ч до повреждения клеток, обладал цитопротекторным эффектом в концентрации 10-7М, а после повреждения перекисью – в концентрациях 10-6 – 10-7М. D-энантиомер этилового эфира N-фенилацетил-глицил-L-пролина (ГЗК-121) и соединение с удлинением N-ацильного фрагмента на CH2-группу (ГЗК-45) были эффективны в концентрациях до 10-6М в обеих схемах эксперимента. Одновременное удлинение N-ацильного фрагмента на CH2-группу и замена эфира на амид (ГЗК-50) приводило к защите клеток от гибели только при внесении соединения после Н2О2. Таким образом, установлено, что все исследуемые замещённые глипролины обладали нейропротекторной активностью в экспериментах in vitro в условиях окислительного стресса на клетках HT-22, причём наиболее выражена она была у соединений ГЗК-119 и ГЗК-115.

Neuroprotective properties of novel substituted glyprolines in vitro

Resume. Previously in the Zakusov Institute of Pharmacology the linear substituted glyproline GZK-111, N-phenylacetyl-glycyl-L-proline ethyl ester, which is capable to convert into the neuropeptide cyclo-prolylglycine (CPG) in biological media and displaying the nootropic, anxiolytic, antihypoxic and neuroprotective activity, was designed and synthesized. The aim of the work was to study the neuroprotective activity of analogues of substituted glyproline GZK-111 at the Cand N-terminus in vitro on the oxidative stress model in comparison to the GPG. Oxidative stress caused by H2O2 (1.5 mM) led to significant decrease in the hippocampal cells HT-22 viability. L-CPG protected cells against H2O2 in concentrations up to 10-7M when applied both 24 h before and immediately after damage. The compound with an open carboxylic group (GZK-115) like CPG protected HT-22 cells from death in both experimental schemes at concentrations up to 10-7M. The substituted amide GZK-119 added 24 h before cell damage, had a cytoprotective effect at a concentration of 10-7M, and after peroxide damage in concentrations of 10-6 – 10-7M. The D-enantiomer of ethyl ester N-phenylacetyl-glycyl-proline (GZK-121) and the compound with the extension of the N-acyl fragment to the CH2group (GZK-45) were effective at concentrations up to 10-6M in both experimental schemes. Simultaneous extension of the N-acyl fragment to the CH2 group and replacement of the ester with an amide (GZK-50) resulted to protection of the cells from death only after H2O2. Thus, it was established that all investigated substituted glyprolines possessed neuroprotective activity in experiments in vitro under conditions of oxidative stress in HT-22 cells. The most active compounds were GZK-119 and GZK-115.

Введение

В 1996 г. в НИИ фармакологии имени В.В. Закусова был открыт эндогенный пептид циклопролилглицин (ЦПГ) [1], для которого были выявлены ноотропные [2], анксиолитические [3], антигипоксические [4] и нейропротекторные свойства [5]. Было показано, что ЦПГ по структуре и фармакологической активности подобен пирацетаму [2–5]. Кроме того, было выявлено, что ЦПГ аналогично пирацетаму оказывает положительное модулирующее действие на глутаматные AMPA-рецепторы [6] и усиливает синтез нейротрофина BDNF [7].

Нами был сконструирован линейный глипролин ГЗК-111, этиловый эфир N-фенилацетил-глицил-L-пролина, химическая структура которого предполагает возможность превращения его в ЦПГ в биологических средах. Действительно, ГЗК-111 in vitro в плазме крови крысы превращается в ЦПГ и проявляет весь спектр фармакологической активности, характерный для последнего [8, 9].

Для расширения группы фармакологически активных замещенных глипролинов в настоящей работе был синтезирован ряд аналогов ГЗК-111 с разным замещением по C- и N-концу и изучена их нейропротекторная активность in vitro.

Цель исследования

Цель данной работы состояла в изучении нейропротекторной активности аналогов замещённого глипролина ГЗК-111 по C- и N-концу in vitro на модели оксидативного стресса в сравнении с ЦПГ.

Материалы и методы

Экспериментальная химическая часть

В работе использовали коммерческие аминокислоты (Sigma, Reanal). Используемые растворители очищали и сушили стандартными методами. Температуру плавления определяли в открытых капиллярах на приборе Optimelt MPA100 (Stanford Research Systems, США) и не корректировали. ПМР-спектры регистрировали в растворах диметилсульфоксида(ДМСО-) или CDCl в шкале δ, м. д. (J, Гц) на спектрометре Fourier 300 (Bruker, Германия) с рабочей частотой 300 МГц. В качестве внутреннего стандарта использовали тетраметилсилан. Удельное оптическое вращение измеряли на поляриметре ADP 440 Polarimeter (Bellingham + Stanley Ltd., Англия).

ТСХ проводили на пластинках Kieselgel 60 G/F254 (Merck, Германия) в системах диоксан – вода 9:1 (А), хлороформ – метанол 9:1 (Б) и бензол – уксусная кислота – вода 3:1:1 (В). Соединения с амидными группами обнаруживали в парах йода, соединения   с открытой карбоксильной группой – бромкрезоловым зелёным, содержащие ароматические группы – в УФ-лучах. Элементный анализ проводили на приборе для определения углерода и водорода с четырьмя электрическими печами (600-900 °С, тип МА-Г/6Р, завод ЛЭТО, Россия) в токе кислорода и на аппарате для определения азота с тремя такими же электрическими печами в токе углекислого газа. Данные элементного анализа соединений относительно процентного содержания С, Н и N отклоняются от теоретических не более чем на 0,4 %.

Энантиомеры   этилового          эфира   N-фенилацетил-глицилпролина (С H -CH -C(O)-Gly-ProOC H ). Получали аналогично [8].

C H -CH -C(O)-Gly-L-Pro-OC H (ГЗК-111): т.пл. 111-112 °С; [α]23 -90,0 ° (с 1, вода); R = 0,80 (А).

CH -CH -C(O)-Gly-D-Pro-OCH(ГЗК-121): т.пл. 112-113 °С; [a]23 +90,0 ° (с 1, вода); R = 0,80 (А). N-фенилацетил-глицил-L-пролин (C6H5-CH2C(O)-Gly-L-Pro-OH, ГЗК-115). Получали аналогично [9]. Т.пл. 165-166 °С; [α]23 -75 ° (с 1, метанол); R = 0,35 (А).

Метиламид       N-фенилацетил-глицил-L-пролина (C H -CH -C(O)-Gly-L-Pro-NHCH , ГЗК-119). Получали аналогично [9]. Т.пл. 180-181 °С; [α]23 -76 ° (с 1, метанол); R = 0,31 (Б).

Этиловый эфир N-фенилпропионил-глицил-L-пролина   (C6H5-(CH2)2-C(O)-Gly-L-Pro-OC2H5, ГЗК-45).

К охлажденному до -10 °С раствору 3 г (14,5 ммоль)мN-фенилпропионил-глицина в 10 мл диметилформамида (ДМФА) при интенсивном перемешивании одновременно прибавляли 1,89 мл (14,5 ммоль) изобутилхлорформиата и 2,32 мл (18,125 ммоль) N-этилморфолина. После 2-3 мин перемешивания прикапывали раствор 3,25 г (18,125 ммоль) хлоргидрата этилового эфира пролина и 1,86 мл (14,5 ммоль) N-этилморфолина в 15 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали ещё 30 мин прим-10 °С и 1 ч при комнатной температуре. Осадок отфильтровывали, фильтрат упаривали в вакууме, остаток растворяли в CHCl3. Раствор последовательно промывали 3 % NaHCO3, водой, 1М раствором HCl и вновь водой, высушивали безводным сульфатом натрия и упаривали. Полученное масло перекристаллизовывали из смеси этилацетата и гексана и получали 3 г (62 %) этилового эфира N-фенилпропионил-глицил-L-пролина в виде кристаллического продукта. Т.пл. 111-112 °С; [α]23 -83° (с 1, этанол); R = 0,8 (В). ПМР-спектр (ДМСО-d ) δ, м.д.: 1,21 (м, 3Н, СН СН О), 1,73-2,27 (м, 5Н, СγН Pro, СβН Pro, Ph-CH -CH ), 2,46 (м, 1Н, СβН Pro), 2,83 (м, 2Н, J1 = 7,82, Ph-CH -CH ), 3,38-3,62 (м, 2Н, СδН Pro), 3,78-4,2 (м, 4Н, СН СН О, СαН Gly), 4,3 (д.д., 1Н, СαН Pro, мажорный конформер), 4,68 (д.д., 1Н, СαН Pro, минорный конформер), 8,06 (т, 1Н, J = 5,12, NH Gly). Элементный анализ: вычислено, %: C 63,39; H 7,37; N 8,20; найдено, %: С 63,18; H 7,33; N 8,75; C H N O * 0,5H O.

Амид N фенилпропионилглицилL – пролина (CH -(CH ) -C(O)-Gly-L-Pro-NH , ГЗК-50). Раствор 0,300 г (0,9036 ммоль) этилового эфира N-фенилпропионил-глицил-L-пролина в 5,625 мл насыщенного аммиаком метанола оставляли плотно закрытым на 14 дней при комнатной температуре. Окончание реакции определяли с помощью ТСХ. После завершения реакции метанольный раствор упарили досуха, полученное масло перекристаллизовывали из этилового спирта. Получали 0,170 г (85 %) амида N-фенилпропионил-глицил-L-пролина в виде кристаллического продукта. Т.пл. 188-190 °С. [α]23 -62,2 ° (с 1, метанол). R = 0,41 (Б). ПМР-спектр (CDCl ) δ, м.д.: 1,93-2,4 (м, 4Н, СβН Pro, СγН Pro), 2,57 (м, 2Н, Ph-CH2-CH2), 2,99 (м, 2Н, Ph-CH2-CH2), 3,42-3,59 (м, 2Н, СδН Pro), 4,05 (д, J = 4,32, 2Н, СαН Gly), 4,3 (д.д., 1Н, СαН Pro, мажорный конформер), 4,57 (д.д., 1Н, СαН Pro, минорный конформер), 5,45 и 6,68 (два с, 2Н, NH2), 6,45 (с, 1Н, NH Gly), 7,2-7,3 (м, 5Н, Ar).

Экспериментальная биологическая часть

Для       экспериментов               использовались             реактивы: Н О (Panreac), MTT (Sigma Aldrich), ДМСО Panreac), среда ДМЕМ (HyClone), фетальная бычья сыворотка FBS (Gibco).

Эксперименты проводились на клетках гиппокампа мыши линии НТ-22 (Голландия, Утрехт). Клетки культивировали в среде ДМЕМ с добавлением 5 % FBS в СО2-инкубаторе при температуре 37 °С в атмосфере, содержащей 5 % CO2.

Оксидативный стресс моделировали путём внесения перекиси водорода в конечной концентрации 1,5 мM) [10]. Спустя 30 мин среду заменяли на обычную. Через 4 ч выполняли измерение жизнеспособности клеток.

Жизнеспособность клеток измеряли с использованием MTT-теста с добавлением 0,5 % раствора бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолия (MTT), для растворения образующихся кристаллов формазана использовали ДМСО. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Multiscan EX при длине волны 600 нм [11].

Исследуемые соединения (ЦПГ, ГЗК-115, ГЗК119, ГЗК-121, ГЗК-45 и ГЗК-50) растворяли в деионизованной воде и вносили за 24 ч до повреждения или сразу после смены среды в конечных концентрациях 10-5 – 10-8М.

Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Краскела-Уоллиса с последующим тестом по Данну (ANOVA). Данные представлены в виде m. ± s.d. Данные считались достоверными при p  0,05.

Результаты и обсуждение

Синтез замещённых глипролинов был осуществлён по общей схеме:

Низкоалкильные эфиры N-фенилалканоил-глицилпролинов (ГЗК-111, ГЗК-121, ГЗК-45) получали (схема 1) методом смешанных ангидридов с использованием изобутилхлорформиата в условиях Андерсона [12]. В качестве карбоксильной компоненты использовали N-фенилалканоилглицин, полученный из глицина и хлорангидрида соответствующей фенилалкановой кислоты по Шоттен-Бауману [13], этиловый эфир пролина, полученные из метанола или абсолютного этанола в присутствии хлористого тионила по методу Бреннера [14]. Амиды N-фенилалканоил-глицил-пролинов (ГЗК-113 и ГЗК-50) получали обработкой этилового эфира соответствующего N-замещённого дипептида аммиаком в метаноле. Дипептид ГЗК-115 с открытой карбоксильной группой получали гидролизом 1 М щёлочью этилового эфира N-фенилацетил-глицил-L-пролина. Метиламид N-фенилацетил-глицил-L-пролина (ГЗК-119) получали аминолизом метиламином соответствующего метилового эфира.

Оксидативный стресс, вызванный Н О (1,5 мM), приводил к достоверному снижению жизнеспособности гиппокампальных клеток линии НТ-22. L-ЦПГ защищал клетки от повреждения Н2О2 в концентрациях до 10-7М в обеих схемах внесения соединения. ГЗК-115 защищал клетки НТ-22 от гибели, подобно L-ЦПГ, в обеих схемах эксперимента в концентрациях до 10-7М. ГЗК-119, внесённый за 24 ч до повреждения клеток, обладал цитопротекторным эффектом в концентрации 10-7М, а после повреждения перекисью – в концентрациях 10-6 – 10-7М. ГЗК-121 и ГЗК-45 были эффективны в концентрациях до 10-6М в обеих схемах эксперимента. ГЗК-50 защищал клетки от гибели только в схеме внесения соединения после Н2О2 (табл.1).

Таким образом, все полученные замещённые глипролины обладали нейропротекторной активностью в экспериментах in vitro в условиях окислительного стресса на клетках HT-22, причём наиболее выраженная наблюдалась для соединений ГЗК-119 и ГЗК-115. Можно предположить, что выявленные нами различия в защитном действии исследуемых замещённых глипролинов на модели оксидативного стресса могут быть обусловлены особенностью строения их молекул.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Участие авторов. Антипова Т.А. – разработка модели, анализ и интерпретация результатов, написание текста, редактирование и финальное утверждение рукописи. Колясникова К.Н. – исполнение экспериментальной работы, написание текста. Волкова Ю.С. – исполнение экспериментальной работы, написание текста. Антипов П.И. – исполнение экспериментальной работы, написание текста. Кузнецова Е.А. – исполнение экспериментальной работы, анализ и интерпретация результатов. Николаев С.В. – исполнение экспериментальной работы, анализ и интерпретация результатов.

Литература / References

1.           Gudasheva TA, Boyko SS, Akparov VKh, et al. Identification of a novel endogenous memory facilitating cyclic dipeptide cyclo-prolylglycine in rat brain. FEBS Letters. 1996;391:149–152.

2.           Гудашева Т.А., Островская Р.У., Трофимов С.С., и др. Новый эндогенный дипептид циклопролилглицин подобен пирацетаму по селективности мнемотропного эффекта // Бюлл. экспер. биол. мед. – 1999. – Т.128. – №10. – С.411–413. [Gudasheva TA, Ostrovskaya RU, Trofimov SS, et al. New Endogenous Dipeptide Cycloprolyl-Glycine Is Similar To Piracetam By Its Mnemotropic Selectivity. Bulletin of experimental biology and medicine. 1999;128(4):411–413. (In Russ).]

3.           Гудашева Т.А., Константинопольский М.А., Островская Р.У., Середенин С.Б. Анксиолитическая активность эндогенного ноотропного пептида циклопропилглицина в тесте приподнятого крестообразного лабиринта // Бюлл. экспер. биол. мед. – 2001. – Т.131.–№5. – С.547–550. [Gudasheva TA, Konstantinopol'skii MA, Ostrovskaya RU, Seredenin SB. Anxiolytic Activity Of Endogenous Nootropic Dipeptide Cycloprolylglycine In Elevated Plus-Maze Test. Bulletin of experimental biology and medicine. 2001;131(5):464–466. (In Russ).]

4.           КолясниковаК.Н., ГудашеваТ.А., НазароваГ.А., идр. Сходство цикло-пролилглицина с пирацетамом по антигипоксическому и нейропротекторному эффектам // Экспер. клин. фармакол. – 2012. –    Т.75. – №9. – С.3–6. [Kolyasnikova KN, Gudasheva TA, Nazarova GA, et al. Similarity of Cycloprolylglycine to Piracetam in Antihypoxic and Neuroprotective Effects. Eksperimental'naia i klinicheskaia farmakologiia. 2012;75(9):3–6. (In Russ).] DOI: https://doi.org/10.30906/0869-2092- 2012-75-9-3-6

5.           Поварнина П.Ю., Колясникова К.Н., Николаев С.В., и др. Нейропептид циклопролилглицин проявляет нейропротекторную активность при системном введении на модели неполной глобальной ишемии у крыс и в условиях глутаматной нейротоксичности in vitro // Бюлл. экспер. биол. мед. – 2015. – Т.160. – №11. – С.600– 603. [Povarnina PY, Kolyasnikova KN, Nikolaev SV, et al. Neuropeptide Cycloprolylglycine Exhibits neuroprotective activity after systemic administration to rats with modeled incomplete global ischemia and in vitro modeled glutamate neurotoxicity. Bulletin of experimental biology and medicine. 2015;160(11):600–603. (In Russ).]

6.           ГудашеваТ.А., ГригорьевВ.В., КолясниковаК.Н., идр. Нейропептид циклопролилглицин является эндогенным положительным модулятором AMPA-рецепторов // Доклады Академии наук. – 2016. –        Т.471. – №1. – С.106–108. [Gudasheva TA, Koliasnikova KN, Seredenin SB, et al. Neuropeptide cycloprolylglycine is an endogenous positive modulator of ampa receptors. Doklady Akademii nauk. 2016;471(1):387– 389 (In Russ).]. DOI: 10.7868/S0869565216310273

7.           Гудашева Т.А., Колясникова К.Н., Антипова Т.А., Середенин С.Б. Нейропептид циклопролилглицин увеличивает содержание мозгового нейротрофического фактора в нейрональных клетках // Доклады Академии наук. – 2016. – Т.469. – №4. – С.492–495. [Gudasheva TA, Koliasnikova KN, Antipova TA, Seredenin SB. Neuropeptide cycloprolylglycine increases the levels of brain-derived neurotrophic factor in neuronal cells. Doklady Akademii nauk. 2016;469(4):273–276. (In Russ).]. DOI: 10.7868/S0869565216220254

8.           ГудашеваТ.А., КолясниковаК.Н., КузнецоваЕ.А., идр. Этиловый эфир N-фенилацетил-глицил-L-пролина метаболизируется до цикло-L-пролилглицина, проявляя сходный спектр нейропсихотропной активности // Хим.-фарм. журн. – 2016. – Т.50. –               №11. – С.3–8. [Gudasheva TA, Kolyasnikova KN, Kuznetsova EA, et al. N-Phenylacetylglycyl-L-Proline Ethyl Ester Converts Into Cyclo-LProlylglycine Showing A Similar Spectrum Of Neuropsychotropic Activity. Pharmaceutical Chemistry Journal. 2016;50(11):3–8. (In Russ).]. DOI: https://doi.org/10.30906/0023-1134-2016-50-11-3-8

9.           Колясникова К.Н., Кузнецова Е.А., Николаев С.В., и др. Анализ зависимости антигипоксической активности от структуры соединений в ряду замещенных глипролинов // Хим.-фарм. журн. – 2018. –   Т.52. – №6. – С.13–17. [Kolyasnikova KN, Kuznetsova EA, Nikolaev SV, et al. Investigation of the Structure Antihypoxic Activity Relationship in a Series of Substituted Glyprolines. Pharmaceutical Chemistry Journal. 2018;52(6):13–17. (In Russ).]. DOI: https://doi.org/10.30906/0023-1134- 2018-52-6-13-17

10.         Jackson GR, Werrbach-Perez K, Ezell EL, et al. Nerve growth factor effects on pyridine nucleotides after oxidant injury of rat pheochromocytoma cells. Brain Res. 1992;592:239–248.

11.         Twentyman PR, Luscombe M. A study of some variables in a tetrazolium dye (MTT) based assay for cell growth and chemosensitivity. Br. J. Cancer. 1987;56(3):279–285.

12.         Anderson GW, Zimmerman JE, Callahan FM. Reinvestigation of the mixed carbonic anhydride method of peptide synthesis. J. Am. Chem. Soc. 1967;89:5012–5017.

13.         Baumann E. Ueber eine einfache Methode der Darstellung von Benzoлsдureдthern. Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1886;19:3218–3222.

14.         Brenner M, Huber W. Herstellung von α-Aminosдureestern durch Alkoholyse der Methylester. Helv. Chim. Acta. 1953;36:1109–1115.

Похожие статьи