Исследование протекторных свойств агониста TrkA-рецептора ГК-2 на модели окислительного стресса в культуре клеток сосудистого эндотелия человека (HUVEC)
Ср, 26 Июнь 2019
203

Резюме. Окислительный стресс приводил к достоверному снижению жизнеспособности клеток по сравнению с контролем (78±5 % и 100±6 % соответственно, р ≤ 0,05). Внесение как ГК-2, так и NGF предотвращало снижение жизнеспособности клеток HUVEC под действием H2O2 (95±3 % для ГК-2 и 97±4 % для NGF против 78±5 % для H2O2, р ≤ 0,05). В контроле количество клеток с конденсированным хроматином составило 9±2, после внесения Н2О2 78±9 (р ≤ 0,05 по сравнению с контролем). Внесение NGF или ГК-2 после Н2О2 достоверно снижало число таких клеток (44±9 и 41±8 соответственно) (р ≤ 0,05 по сравнению с перекисью водорода) и препятствовало развитию морфологических изменений ядерного хроматина. Таким образом, ГК-2, подобно NGF, в культуре клеток эндотелия человека HUVEC препятствует развитию процесса апоптоза, вызванного окислительным стрессом.

Research of neuroprotective properties of TrkA-receptor agonist GK-2 on model of oxidative stress in human vascular endothelial cells (HUVEC)

Resume. Oxidative stress resulted to decrease in cells viability compared to the control (78 ± 5 % and 100 ± 6 %, respectively, р ≤ 0,05). GK-2 and NGF prevented H2O2-induced HUVEC cells damages (95 ± 3 % for HA-2 and 97 ± 4 % for NGF vs. 78 ± 5 % for H2O2, p ≤ 0.05). In control the number of cells with condensed chromatin was 9 ± 2, after the addition of H2O2 78 ± 9 (p ≤ 0.05 compared with the control). The addition of NGF or GK-2 after H2O2 significantly reduced the number of such cells (44 ± 9 and 41 ± 8, respectively) (p ≤ 0.05 compared to hydrogen peroxide) and prevented the development of morphological changes in nuclear chromatin. Thus GK-2, like NGF, in human endothelial cell culture HUVEC prevented the apoptosis development caused by hydrogen peroxide.

Введение

Хронические ишемические состояния, в том числе ишемическая болезнь сердца и хроническая ишемия нижних конечностей лидируют в структуре летальности и инвалидизации. Одним из возможных подходов к лечению этих состояний является использование биоподобных фармакологических агентов, способных посредством стимуляции ангиогенеза обеспечить адекватное кровоснабжение ишемизированных тканей. Такое направление терапии получило название терапевтический ангиогенез или биологическое шунтирование [1]. Наиболее перспективным в этом направлении представляется разработка и внедрение в клиническую практику экзогенных аналогов эндогенных факторов роста [2]. Известно, что фактор роста нервов (NGF) помимо центральной нервной системы синтезируется и экскретируется эндотелиальными и гладкомышечными клетками сосудов, а на их клеточной мембране имеются специфичные для NGFTrkA рецепторы, через которые реализуются его ангиогенные эффекты [3]. В НИИ фармакологии имени В.В. Закусова синтезирован димерный дипептидный миметик 4 петли NGF – соединение ГК-2, обладающий свойствами агониста TrkA рецепторов [4]. Ранее нами в экспериментах, выполненных на культуре клеток эндотелия человека (HUVEC), было показано, что ГК-2 проявляет выраженную ангиогенную активность, соизмеримую с таковой у NGF [5].

Цель исследования

Целью настоящей работы было исследование ангиопротекторных свойств димерного дипептидного миметика 4-й петли NGF ГК-2 в условиях окислительного стресса на культуре клеток эндотелия человека – HUVEC.

Материалы и методы

Для экспериментов использовались реактивы: среда ДМЕМ (HyClone), фетальная бычья сыворотка FBS (Gibco), L-глутамин (ICN) HEPES (ICN), гепарин (Панфарма), желатин (БиолоТ), ECGF (SigmaAldrich), MTT (SigmaAldrich), ДМСО (Panreac), PBS (SigmaAldrich).

Эндотелиальные клетки пупочной вены человека HUVEC культивировали в среде ДMEM с добавлением 20мМ буфера HEPES, 5 ЕД/мл гепарина, 200 мкг/мл ECGF, 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) при 37 C в атмосфере, содержащей 5 % CO2. Клетки рассеивались в 96-луночные планшеты, покрытые желатином, с плотностью 5 тыс. клеток на лунку. Через 24 ч инкубации добавляли перекись водорода (HO ) в конечной концентрации 200 мкМ. Спустя 24 ч культуральную среду, содержащую H2O2, заменяли на нормальную, вносили NGF в качестве положительного контроля в конечной концентрации 100 нг/мл (10–9М) и ГК-2 (10–6М). Затем NGF и ГК-2 вносили каждые 48 ч в течение 6 суток. Через 24 ч после последнего внесения оценивали жизнеспособность клеток и количество клеток с нарушенной структурой хроматина. Жизнеспособность клеток измеряли с использованием MTT-теста. По окончании эксперимента среду отбирали, добавляли 0,5 % раствор 3-(4,5-диметилтиазол2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромида (MTT) в PBS, содержащем 0,9 мМ CaCl2 и 0,5 мМ MgCl2. Для растворения образующихся кристаллов формазана использовали ДМСО. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре MultiscanEX при длине волны 600 нм [6]. Количество клеток с нарушенной структурой хроматина определяли после окрашивания ядерным красителем Хёхст 33258 (1 мкг/мл) в течение 30 мин. Клетки фотографировали при увеличении 200х с помощью микроскопа NikonEclipseTS100-F (Япония) при длине волны возбуждения 340–380 нм и длине волны испускания 435–485 нм. Подсчитывали количество клеток с измененной структурой хроматина в 5 полях зрения в каждой лунке (24 лунки в каждой экспериментальной группе).

Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Краскела-Уоллиса с последующим тестом по Данну (ANOVA). Данные представлены в виде m. ± s.d. Данные считались достоверными при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Для моделирования окислительного стресса использовали Н2О2 (200 мкМ), которая согласно литературным данным стимулирует программируемую гибель клеток – апоптоз [7], сопровождающуюся рядом биохимических и морфологических изменений в клетке: конденсация хроматина, фрагментация ДНК, повышение проницаемости мембран, сжатие клетки. Показано, что окислительный стресс приводил к достоверному снижению жизнеспособности клеток по сравнению с контролем (78 ± 5 и 100 ± 6 % соответственно, р < 0,05) (табл. 1).

NGF (10–9М) и ГК-2 (10–6М) в условиях окислительного стресса проявляли выраженную цитопротекторную активность, предотвращая снижение жизнеспособности клеток HUVEC под действием H2O2 (95 ± 3 % для ГК-2 и 97 ± 4 % для NGF против 78 ± 5 % для H2O2, р  0,05). Поскольку данная концентрация перекиси водорода вызывает, по литературным данным, повреждение хроматина ядра клетки, проводили окрашивание ядерным красителем Хёхст 33258.

В контроле количество клеток с конденсированным хроматином составило 9 ± 2, после внесения Н2О2   78 ± 9 (р  0,05 по сравнению с контролем). NGF или ГК-2 внесенные после Н2О2 достоверно снижали число таких клеток (44 ± 9 и 41 ± 8 соответственно) (р  0,05 по сравнению с перекисью водорода) и препятствовали развитию морфологических изменений ядерного хроматина (рис. 1а, 1б).

Таким образом, ГК-2, подобно NGF, в условиях окислительного стресса не только препятствует снижению жизнеспособности эндотелиальных клеток HUVEC, но и предотвращает повреждение ядерного хроматина.

Конденсация хроматина — это наиболее характерное проявление апоптоза. Хроматин конденсируется по периферии, под мембраной ядра, при этом образуются чётко очерченные плотные массы различной формы и размеров. Ядро может разрываться на два или несколько фрагментов. Механизм конденсации хроматина обусловлен расщеплением ядерной ДНК в местах, связывающих отдельные нуклеосомы, что приводит к развитию большого количества фрагментов. Ранее нами было показано, что внесение как ГК-2, так и NGF в культуру гиппокампальных клеток линии НТ-22 приводило к синтезу белков HSP70 [8]. Хорошо известно, что увеличение содержания HSP70 приводит к возрастанию уровня антиапоптотических белков Bcl-2 и снижению проапоптотических Bax [9]. Кроме того, HSP70 блокирует вовлечение прокаспазы-9 в апоптосомы, а также саму каспазу-9 [10]. HSP70 может связываться с эндонуклеазой EndoG и блокировать транслокацию этого проапоптотического фактора в ядро [11]. Таким образом, антиапоптотическое действие ГК-2 может быть опосредовано его влиянием на синтез белков теплового шока HSP70, являющихся основным звеном защиты клеток от повреждений, в том числе вызванных окислительным стрессом.

Вывод

Димерный дипептидный миметик 4-й петли NGF — соединение ГК-2, подобно NGF, в культуре клеток эндотелия человека HUVEC препятствует развитию процесса апоптоза, вызванного окислительным стрессом.

Участие авторов. Антипова Т.А. – разработка модели, анализ и интерпретация результатов, написание текста, редактирование и финальное утверждение рукописи. Николаев С.В. – выполнение экспериментальной работы, написание текста, подготовка иллюстраций. Крыжановский С.А. – написание текста, редактирование и финальное утверждение рукописи. Пекельдина Е.С. – выполнение экспериментальной работы, написание текста.

Литература / References

1.               Парфенова Е.В., Ткачук В.А. Терапевтический ангтогенез: достижения, проблемы, перспективы // Кардиологический вестник. – 2017. – Т. 2. – № 2(14). – С. 5–14. [Parfenova EV, Tkachuk VA. Therapeutic angiogenesis: advances, problems, prospects. Kardiologicheskij vestnik. 2007;2(2(14)):5–15. (In Russ).]

2.               Ko SH, Bandyk DF. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia. Semin. Vasc. Surg. 2014;27:1:23–31.

3.               Blais M, L vesque P, Bellenfant S, Berthod F. Nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, neurotrophin-3 and glial-derived neurotrophic factor enhance angiogenesis in a tissue-engineered in vitro model. TissueEng. PartA. 2013;19(15–16):1655–1664.

4.               Гудашева Т.А., Антипова Т.А., Середенин С.Б. Новые низкомолекулярные миметики фактора роста нервов // ДАН. – 2010. – Т. 434. – № 4. – С. 549–552. [Gudasheva TA, Antipova TA, Seredenin SB. Novel low-molecular-weight mimetics of the nerve growth factor. Doklady Biochemistry and Biophysics. 2010;434(4):549–552. (In Russ).]

5.               Крыжановский С.А., Антипова Т.А., Цорин И.Б., и др. Ангиогенные эффекты димерного дипептидного миметика четвертой петли фактора роста нервов // Бюл. эксперим. биол. и медицины. – 2016. – Т. 161. – № 4. – С. 503–507. [Kryzhanovskii SA, Antipova TA, Tsorin IB. Angiogenic effects of dimeric dipeptide mimetic of loop 4 of nerve growth factor. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2016;161(4):513–517. (In Russ).]

4.               Cai H, Harrison DG. Endothelial dysfunction in cardiovascular diseases:the role of oxidant stress. Circ. Res. 2000;87(10)840–844.

5.               Berry C, Brosnan MJ, Fennell JP, et al. Oxidative stress and vascular damage in hypertension. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2001;10(2):247–255.

6.               Twentyman PR, Luscombe M. A study of some variables in a tetrazolium dye (MTT) based assay for cell growth and chemosensitivity. Br. J. Cancer. 1987;56:279–285.

7.               Mu P, Liu Q, Zheng R. Biphasic regulation of H2O2 on angiogenesis implicated NADPH oxidase. CellBiologyInternational. 2010;34(10):1013–1020.

8.               Антипова Т.А. Нейропротекторное действие низкомолекулярного пептидного миметика фактора роста нервов NGF ГК-2 связано с активацией синтеза белков теплового шока HSP32 и HSP70 и увеличением фосфорилирования TrkA // Эксперим. и клин. фармакол. – 2010. – Т. 73. – № 12. – С. 6–8. [Antipova TA. Neuroprotective effect of lowmolecular peptide mimetic (GK-2) of nerve growth factor is related to activated synthesis of heat shock proteins (HSP32 and HSP70) and increased phosphorylation of TrkA receptor. Eksperim. i klin. Farmakol. 2010;73(12):6–8. (In Russ).] DOI: https://doi.org/10.30906/0869-2092-2010-73-12-6-8.

9.               Stankiewicz AR, Lachapelle G, Foo CP, et al. Hsp70 inhibits heatinduced apoptosis upstream of mitochondria by preventing Bax translocation. J. Biol. Chem. 2005;280(46):38729-38739.

10.             Saleh A, Srinivasula SM, Balkir L, Robbins PD, Alnemri ES. Negative regulation of the APAF-1 apoptosome by HSP70. Nat. Cell Biology. 2000;2(8):476–483.

11.             Kalinowska M, Garncarz W, Pietrowska M, et al. Regulation of the human apoptotic DNase/RNase Endonuclease G: Involvement of Hsp70 and ATP. Apoptosis. 2005;10(4):821–830.

Похожие статьи